CRISPRスクリーンは、肝細胞のアデノ関連ウイルス制限因子として細胞極性決定要因3を識別します。

アデノ関連ウイルス（AAV）は、有望な遺伝子治療ベクターに発達したヘルパー依存性パルボウイルスです。最近の偏りのないゲノムスクリーンを含む多くの研究は、AAV細胞の侵入に不可欠な宿主因子を特定していますが、抑制性宿主因子に対処するゲノム全体のスクリーンは報告されていません。ここでは、新しいCRISPRスクリーンを利用して、ヒト肝細胞細胞株のAAV制限因子を特定します。機能獲得画面からの主要なヒットは、頂点極性決定要因3（CRB3）です。CRB3のノックアウト（KO）はAAVの伝達を促進しますが、過剰発現は反対の効果を発揮します。さらに、CRB3は、血清型および細胞型固有の方法でAAVの伝達を制限するように見えます。特に、AAV血清型9および合理的に操作されたAAVバリアントの場合、普遍的なAAV受容体ではなくCRB3 KO細胞の表面でのガラクトシル化グリカンの利用可能性が増加することが、カプシド付着の増加と変化の増加につながることを示しています。CRB3は、頂端底極性とタイトな接合部の完全性を維持することにより、細胞表面のAAVグリカン付着因子の利用可能性を制限する重要な分子決定因子として機能する可能性があると仮定します。ただし、さまざまな細胞タイプのAAV形質導入に影響を与える宿主要因の理解はまだ進化しています。本研究では、ゲノムスケールのCRISPRノックアウトスクリーンを実行して、肝細胞培養のAAV感染を制限する細胞宿主因子を特定します。細胞極性を決定するパン粉3は、細胞表面の特定の炭水化物付着因子の分布にも影響することがわかります。これは、ビリオンが細胞に結合して入る能力に影響します。この研究は、AAV輸血における細胞極性の重要性を強調し、細胞培養と臓器系における微分感染メカニズムの潜在的な分子基盤を提供します。

Adeno-associated viruses (AAV) are helper-dependent parvoviruses that have been developed into promising gene therapy vectors. Many studies, including a recent unbiased genomic screen, have identified host factors essential for AAV cell entry, but no genome-wide screens that address inhibitory host factors have been reported. Here, we utilize a novel CRISPR screen to identify AAV restriction factors in a human hepatocyte cell line. The major hit from our gain-of-function screen is the apical polarity determinant Crumbs 3 (Crb3). Knockout (KO) of Crb3 enhances AAV transduction, while overexpression exerts the opposite effect. Further, Crb3 appears to restrict AAV transduction in a serotype- and cell type-specific manner. Particularly, for AAV serotype 9 and a rationally engineered AAV variant, we demonstrate that increased availability of galactosylated glycans on the surfaces of Crb3 KO cells, but not the universal AAV receptor, leads to increased capsid attachment and enhanced transduction. We postulate that Crb3 could serve as a key molecular determinant that restricts the availability of AAV glycan attachment factors on the cell surface by maintaining apical-basal polarity and tight junction integrity.IMPORTANCE Adeno-associated viruses (AAVs) have recently emerged at the forefront as gene therapy vectors; however, our understanding of host factors that influence AAV transduction in different cell types is still evolving. In the present study, we perform a genome-scale CRISPR knockout screen to identify cellular host factors that restrict AAV infection in hepatocyte cultures. We discover that Crumbs 3, which determines cellular polarity, also influences the distribution of certain carbohydrate attachment factors on the cell surface. This in turn affects the ability of virions to bind and enter the cells. This study underscores the importance of cell polarity in AAV transduction and provides a potential molecular basis for the differential infectious mechanism(s) in cell culture versus organ systems.