不死化マウス胚性線維芽細胞のための戦略の比較

遺伝的に適切なマウスモデルは、マウス胚性線維芽細胞（MEF）が由来する遺伝的に定義された系統の大規模なコレクションをもたらしました。それらの広範な使用にもかかわらず、MEFは生成するのに時間がかかり、寿命が限られています。目的の遺伝子操作で一次MEFを不死化すると、培養維持時間が大幅に短縮され、ほぼ無限の量のタンパク質溶解物が生成され、実験中の生物学的複製が促進されます。この作業では、MEFの不死化に関するいくつかのアプローチを評価しました。3％O2で栽培されると、40±55時間の中央値倍率で40回以上の一次MEF系統を増殖させることができます（n = 8）。ただし、3％O2での連続合格は、さまざまな成功を収めて自発的な不死化を達成しました。培養物が3％O2で栽培されたときにヘイフリック限界に達しているように見える場合、培地に5 µMの岩阻害剤Y-27632を補充するのに役立ち、増殖を延長し、自発的な不滅を達成しました。SV40 TA感染を介して不死化されたMEFSは、25±9時間の中央値倍率で90％を超える生存率で確実に生成されました。さまざまな不死化戦略で生成された細胞株の特性の議論に加えて、各戦略の長所と短所が含まれているように、不死化MEFを生成するための推奨事項と同様に含まれています。

The genetically amenable mouse model has led to a large collection of genetically defined lines from which mouse embryonic fibroblasts (MEFs) have been derived. Despite their widespread use, MEFs are time consuming to generate and have a limited lifespan. Immortalizing primary MEFs with the desired genetic manipulations greatly reduces culture maintenance time, enables the generation of near limitless amounts of protein lysate, and facilitates biological replicates during experimentation. In this work, we have evaluated several approaches for MEF immortalization. When cultivated at 3% O2, some primary MEF lines could be proliferated for > 40 passages with a median doubling rate of 45 ± 55 h (n = 8). However, serial passaging at 3% O2 achieved spontaneous immortalization with varying success. If cultures seemed to be reaching their Hayflick limit when cultivated at 3% O2, supplementing the culture media with 5 µM ROCK inhibitor Y-27632 helped to extend proliferation and achieve spontaneous immortalization. MEFs immortalized via SV40 Ta infection reliably produced cell lines with a median doubling rate of 25 ± 9 h (n = 9) and viability greater than 90%. In addition to a discussion of the characteristics of cell lines generated with various immortalization strategies, pros and cons of each strategy are included as are recommendations for generating immortalized MEFs.