細胞内標識の汎用性のある手段：ビオシチンの注入とアビジンコンジュゲートによる検出

ビオシチンは、約65％のビオチンを含む低分子量のビオチン - リジン複合体であり、アビジンに対する高い親和性を保持しています。後者の分子はいくつかの組織化学マーカーに結合しているため、細胞内マーカーとしての生物細胞の使用が調査されました。電極には、0.5 m kClおよび0.05 m Trisバッファー、pH 7-7.6に溶解した4〜6％の生物細胞の溶液で満たされました。ニューロンは、ラット上眼 - 腫瘍性疾患系の外植片調製の外植片調製の外眼核で細胞内で記録され、過分極または脱分極電流のいずれかで1〜20分間注入されました。さまざまな回復時間に続いて、外植片を10％ホルマリンまたは4％パラホルムアルデヒドのいずれかで一晩固定し、ビブラトームに切断し、アビジンビオチン複合体（ABC）またはフルオレセイン、ローダミン、テキサス州レッドまたはレッドまたはレッドに共役していたアビジンとインキュベートしました。西洋わさびペルオキシダーゼと1％のTriton-X100を含む。注入されたニューロンの割合は、ほぼ同等の成功を収めた各ラベルを使用して回収されました。電極の詰まりがほとんどない場合、陰性または陽性の電流注入の両方を使用できます。蛍光コンジュゲートとの標識は、ルシファーイエローの標識と定性的に類似していましたが、アビジンとの標識を西洋ワサブペルオキシダーゼまたはABCと結合することは、ニューロンを西洋ワサイドペルオキシダーゼで直接充填することと定性的に類似していました。この手法の利点は、生物細胞の注入の容易さと、捜査官が光発光および光吸収画像の中から選択できるようにする汎用性です。

Biocytin is a biotin-lysine complex of low molecular weight containing about 65% biotin, which retains a high affinity for avidin. Since the latter molecule has been conjugated to several histochemical markers, the use of biocytin as an intracellular marker was investigated. Electrodes were filled with a solution of 4-6% biocytin dissolved in 0.5 M KCl and 0.05 M Tris buffer, pH 7-7.6. Neurons were recorded intracellularly in the supraoptic nucleus of an explant preparation of the rat supraoptico-neurohypophysial system and injected for 1-20 min with either hyperpolarizing or depolarizing current. Following variable recovery times, the explants were fixed in either 10% formalin or 4% paraformaldehyde overnight, sectioned on a vibratome, and incubated with the avidin-biotin complex (ABC) or avidin which had been conjugated to fluorescein, rhodamine, Texas Red or horseradish peroxidase and containing 1% Triton-X 100. A high percentage of injected neurons were recovered using each of the labels with about equal success. Both negative or positive current injection could be used with little electrode clogging. Labeling with fluorescent conjugates was qualitatively similar to that of Lucifer Yellow, whereas labeling with avidin coupled to horseradish peroxidase or with ABC was qualitatively similar to filling neurons directly with horseradish peroxidase. The advantages of this technique are the ease of injection of biocytin and the versatility in allowing the investigator to choose among light-emitting and light-absorbing images.