シングルスライド（MICSS）の多重化免疫組織化学連続染色：高次元組織分析のための多重化発色IHCアッセイ

疾患状態と細胞区画は、驚くべき量の不均一性を示すことができ、この不均一性を真に評価するには、存在する各亜集団を検出およびプローブする能力が必要です。無数の最近のシングルセルアッセイにより、これらの多様な細胞集団の詳細な分析が可能になりました。ただし、各セルタイプ間の相互作用を完全に理解するには、単なる存在だけでなく、空間組織とその関係についても知識が必要です。免疫組織化学は、細胞と組織の視覚化を可能にします。ただし、標準的な手法では、複雑な細胞不均一性の詳細な分析を可能にすることはできません。免疫蛍光や多重免疫組織化学などの多くのマルチプレックスイメージング技術が、より多くの細胞マーカーを一度に調査できるように提案されています。ただし、これらの手法の多くにはまだ制限があります。蛍光マーカーの使用には、スペクトルオーバーラップのために同時に使用できるプローブの数に固有の制限があります。さらに、他の提案されているマルチプレックスIHCメソッドは時間がかかり、高価な試薬が必要です。それでも、多くの方法は凍結組織に依存しており、これは人間の病理学的評価の基準から逸脱しています。ここでは、単一のスライド上の連続したマーカーを染色するマルチプレックスIHC技術について説明します。これは、標準のIHCと同様のステップと同様の試薬を使用するため、標準のIHC機能を備えたラボがこの有用な手順を実行することを可能にします。この方法は検証され、染色サイクル間の交差反応性のリスクなしに連続したマーカーを染色できることを確認しました。さらに、この手法は、その後のエピトープの抗原性の低下につながっていないことを検証しました。

Disease states and cellular compartments can display a remarkable amount of heterogeneity, and truly appreciating this heterogeneity requires the ability to detect and probe each subpopulation present. A myriad of recent single-cell assays has allowed for in-depth analysis of these diverse cellular populations; however, fully understanding the interplay between each cell type requires knowledge not only of their mere presence but also of their spatial organization and their relation one to the other. Immunohistochemistry allows for the visualization of cells and tissue; however, standard techniques only allow for the use of very few probes on a single specimen, not allowing for in-depth analysis of complex cellular heterogeneity. A number of multiplex imaging techniques, such as immunofluorescence and multiplex immunohistochemistry, have been proposed to allow probing more cellular markers at once; however, many of these techniques still have their limitations. The use of fluorescent markers has an inherent limitation to the number of probes that can be simultaneously used due to spectral overlap. Moreover, other proposed multiplex IHC methods are time-consuming and require expensive reagents. Still, many of the methods rely on frozen tissue, which deviates from standards in human pathological evaluation. Here, we describe a multiplex IHC technique, staining for consecutive markers on a single slide, which utilizes similar steps and similar reagents as standard IHC, thus making it possible for any lab with standard IHC capabilities to perform this useful procedure. This method has been validated and confirmed that consecutive markers can be stained without the risk of cross-reactivity between staining cycles. Furthermore, we have validated that this technique does not lead to decreased antigenicity of subsequent epitopes probed, nor does it lead to steric hindrance.