in vitroおよびin vivoアプリケーション用のアデノ関連ウイルスベクターの生産

細胞または生きている動物に関心のある遺伝子を提供して表現することは、生物医学研究と遺伝子治療における極めて重要な技術となっています。ウイルス送達システムの中で、アデノ関連ウイルス（AAV）は比較的安全であり、高い遺伝子導入効率、低免疫原性、安定した長期発現、および選択的組織トロピズムを示しています。細胞特異的プロモーター、CRE/LOXシステム、ゲノム編集などの最新の遺伝子技術と組み合わせることで、AAVは条件付きノックアウトおよびトランスジェニックマウスモデルの実用的で迅速かつ経済的な代替品を表しています。ただし、非現実的な浄化戦略や低ウイルス量など、広範囲にわたるAAV利用の主な障害が残っています。ここでは、改善されたプロトコルを報告して、血清型に依存しない精製AAVを経済的に生成します。ヘルパーフリーのAAVシステムを使用して、HEK293T細胞溶解物からのAAVを精製し、その後の2相分割によりポリエチレングリコール沈殿剤による培地を精製しました。さらに、我々はヨディキサノール勾配精製を実装し、その結果、in vivoでの使用に適した純度の製剤をもたらしました。注目すべきことに、標準プロトコルで使用される通常の数のHEK293T細胞よりも5倍少ない典型的な生産量が最大1 mLで、µLあたり1010-1011ウイルスゲノムコピーの力価を達成しました。概念実証については、ウエスタンブロット、QPCR、発光、および免疫組織化学を介してin vivoの形質導入を検証しました。グルタレドキシン-1（GLRX）shRNAをコードするAAVSは、肝臓および骨格筋でGLRX発現を〜66％阻害しました。私たちの研究は、より経済的で効率的な精製AAV準備のための改善されたプロトコルを提供します。

Delivering and expressing a gene of interest in cells or living animals has become a pivotal technique in biomedical research and gene therapy. Among viral delivery systems, adeno-associated viruses (AAVs) are relatively safe and demonstrate high gene transfer efficiency, low immunogenicity, stable long-term expression, and selective tissue tropism. Combined with modern gene technologies, such as cell-specific promoters, the Cre/lox system, and genome editing, AAVs represent a practical, rapid, and economical alternative to conditional knockout and transgenic mouse models. However, major obstacles remain for widespread AAV utilization, such as impractical purification strategies and low viral quantities. Here, we report an improved protocol to produce serotype-independent purified AAVs economically. Using a helper-free AAV system, we purified AAVs from HEK293T cell lysates and medium by polyethylene glycol precipitation with subsequent aqueous two-phase partitioning. Furthermore, we then implemented an iodixanol gradient purification, which resulted in preparations with purities adequate for in vivo use. Of note, we achieved titers of 1010-1011 viral genome copies per µl with a typical production volume of up to 1 ml while requiring five times less than the usual number of HEK293T cells used in standard protocols. For proof of concept, we verified in vivo transduction via Western blot, qPCR, luminescence, and immunohistochemistry. AAVs coding for glutaredoxin-1 (Glrx) shRNA successfully inhibited Glrx expression by ~66% in the liver and skeletal muscle. Our study provides an improved protocol for a more economical and efficient purified AAV preparation.