タンデム質量分析による微生物の高速プロテオタイピングのためのサンプル調製方法の評価

タンデム質量分析ベースのプロテオタイピングは、分類法の観点から微生物を特徴付けることができ、いくつかの生態系からの微生物の多様性を調査するための重要なツールになりつつあります。プロテオタイピングをハイスループット法として有効にするには、タンデム質量分析に適したペプチドプールを取得するための高速で自動化可能なサンプル準備が必要です。第一に、いくつかの代表的な細菌および真核生物の微生物の溶解の収量を増加させるプロトコルは、洗剤の存在下で0.1 mmシリカビーズ、0.1および0.5 mmのガラスビーズを備えた長くて劇的なビーズビート設定を使用して最適化されました。次に、これらの抽出物からより大きな消化収量を得るための3つの異なる方法をテストし、効率を改善し、アプリケーション時間を短縮するために最適化されました：タンパク質の非脱塗布およびゲル内タンパク質分解、懸濁液閉じたフィルターベースのアプローチ（S-TRAP）、および固体-SP3という名前の相を強化したサンプル準備。後者の方法は、速度の点で他の2つよりも優れており、ゲル内タンパク質分解（両方で2.2倍）およびS-Trapアプローチ（それぞれ1.3と1.2倍）よりも多くのペプチドとタンパク質を提供します。したがって、SP3はタンデム質量分析プロテオタイピングを直接改善します。

Tandem mass spectrometry-based proteotyping allows characterizing microorganisms in terms of taxonomy and is becoming an important tool for investigating microbial diversity from several ecosystems. Fast and automatable sample preparation for obtaining peptide pools amenable to tandem mass spectrometry is necessary for enabling proteotyping as a high-throughput method. First, the protocol to increase the yield of lysis of several representative bacterial and eukaryotic microorganisms was optimized by using a long and drastic bead-beating setting with 0.1 mm silica beads, 0.1 and 0.5 mm glass beads, in presence of detergents. Then, three different methods to obtain greater digestion yield from these extracts were tested and optimized for improve efficiency and reduce application time: denaturing electrophoresis of proteins and in-gel proteolysis, suspension-trapping filter-based approach (S-Trap) and, solid-phase-enhanced sample preparation named SP3. The latter method outperforms the other two in terms of speed and delivers also more peptides and proteins than with the in-gel proteolysis (2.2 fold for both) and S-trap approaches (1.3 and 1.2 fold, respectively). Thus, SP3 directly improves tandem mass spectrometry proteotyping.