von Willebrand因子のD 'ドメイン領域Arg782-Cys799は、因子VIIIの結合に貢献しています

Von Willebrand因子（VWF）因子VIII（FVIII）との複合体では、循環からの迅速なクリアランスから保護されています。FVIII結合部位はVWFのN末端D'-D3ドメインに存在することが確立されていますが、FVIII結合に寄与するアミノ酸領域に関する詳細情報はまだ不足しています。本研究では、VWFのFVIII結合領域への洞察を得るために、水素補給物質質量分析が採用されました。この目的のために、時間依存性重水素取り込みは、D'-D3およびFVIII-D'-D3複合体で評価されました。データは、D'-D3と比較して、FVIII-D'-D3複合体におけるD 'Region Arg782-Cys799での重水素取り込みの減少を示しました。これは、この領域がFVIIIと相互作用することを意味します。Arg782-Cys799における6つの帯電したアミノ酸の部位指向変異誘発と、アラニン残基に続いて表面プラズモン共鳴分析と固相結合研究により、ASP796の置換がFVIII結合に影響を与えることが明らかになりました。D'-D3 GLU787ALAバリアントでは、FVIII結合の著しい減少が観察されました。ASP796とGLU787がASN796とGLN787に置き換えられたD'-D3バリアントでも同じことが観察されました。Glu787およびCys789とともに、D'-D3の結晶構造に短いらせん領域を形成するLeu786の部位指向変異誘発も、FVIII結合に顕著な影響を与えました。結合された結果は、アミノ酸領域Arg782-Cys799がFVIII結合表面の一部であることを示しています。私たちの研究は、FVIII-VWF複合体の形成と、FVIIIのレベルが著しく低下したことによって引き起こされる出血に関連する可能性のある欠陥に関する新しい洞察を提供します。

In the complex with von Willebrand factor (VWF) factor VIII (FVIII) is protected from rapid clearance from circulation. Although it has been established that the FVIII binding site resides in the N-terminal D'-D3 domains of VWF, detailed information about the amino acid regions that contribute to FVIII binding is still lacking. In the present study, hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry was employed to gain insight into the FVIII binding region on VWF. To this end, time-dependent deuterium incorporation was assessed in D'-D3 and the FVIII-D'-D3 complex. Data showed reduced deuterium incorporation in the D' region Arg782-Cys799 in the FVIII-D'-D3 complex compared to D'-D3. This implies that this region interacts with FVIII. Site-directed mutagenesis of the six charged amino acids in Arg782-Cys799 into alanine residues followed by surface plasmon resonance analysis and solid phase binding studies revealed that replacement of Asp796 affected FVIII binding. A marked decrease in FVIII binding was observed for the D'-D3 Glu787Ala variant. The same was observed for D'-D3 variants in which Asp796 and Glu787 were replaced by Asn796 and Gln787. Site-directed mutagenesis of Leu786, which together with Glu787 and Cys789 forms a short helical region in the crystal structure of D'-D3, also had a marked impact on FVIII binding. The combined results show that the amino acid region Arg782-Cys799 is part of a FVIII binding surface. Our study provides new insight into FVIII-VWF complex formation and defects therein that may be associated with bleeding caused by markedly reduced levels of FVIII.