アゴニスト誘発性アデノシンA1受容体の内在化を監視するためのナノビット補完

長期にわたるアゴニスト治療に応答した受容体の内在化は、Gタンパク質共役受容体（GPCR）機能の重要な調節因子です。アデノシンA1受容体（A1AR）は、GPCRのアデノシン受容体ファミリーの1つであり、そのアゴニスト誘発性の内在化の証拠は曖昧です。最近開発されたNanobitテクノロジーは、分割されたNanoluc Luciferaseを使用して、タンパク質相互作用の変化を監視しています。n末端のヒトA1ARを、小さな高親和性タグで変更しました。大きなナノルックサブユニット（LGBIT）の存在下では、補完が発生し、完全な機能的ナノルックルシフェラーゼを再構成します。ここでは、補完された発光を使用して、生きているHEK293細胞におけるA1ARの内在化を監視しました。アゴニスト治療は、細胞表面発光の堅牢な減少をもたらし、A1ARの内在化の増加を示しています。これらの応答は、A1AR選択的拮抗薬1,3-ジップロピル-8-シクロペンチルキサンチン（DPCPX）によって阻害され、蛍光A1受容体拮抗薬とのリガンド結合を使用して測定した拮抗薬親和性（CA200645）によって阻害されました。A1ARの内在化を誘導するアゴニストの効力は、リガンド結合によって以前に決定された親和性と非常に類似しており、内在化応答の増幅はほとんどまたはまったく増幅されていません。HIBITタグを外因性精製LGBitに補完することにより、HIBIT-A1ARを使用してナノブレットリガンド結合実験を実行することも可能でした。この研究は、A1ARの内在化を監視するためにNanobitテクノロジーの使用を実証し、これらの実験をナノブレットリガンド結合アッセイと組み合わせる可能性を提供します。

Receptor internalization in response to prolonged agonist treatment is an important regulator of G protein-coupled receptor (GPCR) function. The adenosine A1 receptor (A1AR) is one of the adenosine receptor family of GPCRs, and evidence for its agonist-induced internalization is equivocal. The recently developed NanoBiT technology uses split NanoLuc Luciferase to monitor changes in protein interactions. We have modified the human A1AR on the N-terminus with the small high-affinity HiBiT tag. In the presence of the large NanoLuc subunit (LgBiT), complementation occurs, reconstituting a full-length functional NanoLuc Luciferase. Here, we have used complemented luminescence to monitor the internalization of the A1AR in living HEK293 cells. Agonist treatment resulted in a robust decrease in cell-surface luminescence, indicating an increase in A1AR internalization. These responses were inhibited by the A1AR-selective antagonist 1,3-dipropyl-8-cyclopentylxanthine (DPCPX), with an antagonist affinity that closely matched that measured using ligand binding with a fluorescent A1 receptor antagonist (CA200645). The agonist potencies for inducing A1AR internalization were very similar to the affinities previously determined by ligand binding, suggesting little or no amplification of the internalization response. By complementing the HiBiT tag to exogenous purified LgBiT, it was also possible to perform NanoBRET ligand-binding experiments using HiBiT-A1AR. This study demonstrates the use of NanoBiT technology to monitor internalization of the A1AR and offers the potential to combine these experiments with NanoBRET ligand-binding assays.