ライブセルイメージングを使用した小胞ATP放出の蛍光標識と定量化

アデノシン三リン酸（ATP）は、小胞状ヌクレオチド輸送体、VNUT、遺伝子、溶質キャリア17、メンバー9（SLC17A9）によってコードされるvNUTによって、プリン作動性神経伝達のために小胞に積極的に輸送されます。この章では、VNUT陽性細胞の蛍光標識と、ライブセルイメージングを使用した小胞ATP放出の定量化の方法について説明します。VNUTに対する抗体による生存可能な解離ニューロンの調製および細胞標識の方向、および蛍光ATPマーカー、キナクリンまたはMANT-ATPを含むシナプス小胞を含むATPについては詳細です。共焦点顕微鏡のライブセルイメージングを使用して、vNUTの陽性細胞は、細胞膜の近くの離散性涙点として発生する蛍光ATP小胞マーカーと共局在して観察できます。脱分極性の高いカリウム生理学的生理食塩水で刺激された小胞放出は、細胞膜でのATPマーカー蛍光低下を誘導し、これを時間の経過とともに定量化してATP放出を評価できます。電圧ゲートカルシウムチャネルブロッカーであるカドミウムによる前処理は、脱分極誘発膜蛍光の変化をブロックし、vNUT陽性ニューロンがカルシウム依存性エキソサイトーシスを介してATPを放出することを示唆しています。この手法は、末梢および中枢神経系全体で小胞ATP放出を定量化するために適用され、プリン作動性神経伝達の複雑さを発表するのに役立ちます。

Adenosine triphosphate (ATP) is actively transported into vesicles for purinergic neurotransmission by the vesicular nucleotide transporter, VNUT, encoded by the gene, solute carrier 17, member 9 (SLC17A9). In this chapter, methods are described for fluorescent labeling of VNUT positive cells and quantification of vesicular ATP release using live cell imaging. Directions for preparation of viable dissociated neurons and cellular labeling with an antibody against VNUT and for ATP containing synaptic vesicles with fluorescent ATP markers, quinacrine or MANT-ATP, are detailed. Using confocal microscope live cell imaging, cells positive for VNUT can be observed colocalized with fluorescent ATP vesicular markers, which occur as discrete puncta near the cell membrane. Vesicular release, stimulated with a depolarizing, high potassium physiological saline solution induces ATP marker fluorescence reduction at the cell membrane and this can be quantified over time to assess ATP release. Pretreatment with the voltage gated calcium channel blocker, cadmium, blocks depolarization-induced membrane fluorescence changes, suggesting that VNUT-positive neurons release ATP via calcium-dependent exocytosis. This technique may be applied for quantifying vesicular ATP release across the peripheral and central nervous system and is useful for unveiling the intricacies of purinergic neurotransmission.