触媒活性を高めるためのジスルフィド操作リパーゼ：BTL2の構造ベースのアプローチ

加水分解活性の強化、制御、およびリパーゼの特異性の調整は、業界の主要な目標です。I.5ファミリーからの熱アルカリックリパーゼは、高い熱安定性やアルカリ性pHに対する耐性などのネイティブの利点を持ち、バイオテクノロジー応用の標的です。リパーゼ活性を高めるためにいくつかの戦略が適用されていますが、他の能力を損なうことなくタンパク質工学による強化は依然としてとらえどころのないものです。i.5ファミリーのリパーゼは、閉じた不活性な状態からオープンで酵素的に活性な立体構造に移行するために、ユニークで繊細な二重蓋の再構造を患っています。野生型Geobacillus thermocatenulatus Lipase 2（BTL2）の活性を高めるために、その三次元構造に基づいて合理的に設計された、オープン状態をロックするためにジスルフィド結合を形成できる変異体（CCBTL2）。CCBTL2は、A191およびF206をシステイン残基に置き換えて生成され、野生型C64とC295の両方がセリンに変異しました。共有結合固定化されたCCBTL2は、0.1％Triton X-100（2336 IU MG-1）でエステラーゼ活性の3.5倍の増加を示し、0.01％CTAB（778 IU MG-1）で最大6.0倍高く、BTL2と比較した場合、酸化スルフヒドリル剤の酸化。最適なアルカリフィリックpHや高い熱安定性など、BTL2の顕著で産業的に望ましい特徴は影響を受けませんでした。設計されたジスルフィド結合はまた、CCBTL2で観察された活動の増加が酸化還元前処理によって制御されたため、強化に可逆性を付与しました。MDシミュレーションは、CCBTL2の最も安定した立体構造（ジスルフィド結合が形成された）が、予測したように、このリパーゼのオープンで活性な立体構造に似ていることを示唆しました。

Enhancement, control, and tuning of hydrolytic activity and specificity of lipases are major goals for the industry. Thermoalkaliphilic lipases from the I.5 family, with their native advantages such as high thermostability and tolerance to alkaline pHs, are a target for biotechnological applications. Although several strategies have been applied to increase lipases activity, the enhancement through protein engineering without compromising other capabilities is still elusive. Lipases from the I.5 family suffer a unique and delicate double lid restructuration to transition from a closed and inactive state to their open and enzymatically active conformation. In order to increase the activity of the wild type Geobacillus thermocatenulatus lipase 2 (BTL2) we rationally designed, based on its tridimensional structure, a mutant (ccBTL2) capable of forming a disulfide bond to lock the open state. ccBTL2 was generated replacing A191 and F206 to cysteine residues while both wild type C64 and C295 were mutated to serine. A covalently immobilized ccBTL2 showed a 3.5-fold increment in esterase activity with 0.1% Triton X-100 (2336 IU mg-1) and up to 6.0-fold higher with 0.01% CTAB (778 IU mg-1), both in the presence of oxidizing sulfhydryl agents, when compared to BTL2. The remarkable and industrially desired features of BTL2 such as optimal alkaliphilic pH and high thermal stability were not affected. The designed disulfide bond also conferred reversibility to the enhancement, as the increment on activity observed for ccBTL2 was controlled by redox pretreatments. MD simulations suggested that the most stable conformation for ccBTL2 (with the disulfide bond formed) was, as we predicted, similar to the open and active conformation of this lipase.