酸化ストレス中のフィブロネクチン上の上皮細胞の細胞接着と拡散のダイナミクスを調べる

細胞外マトリックス（ECM）への細胞の接着と拡散は、生物の発達中および成体組織の恒常性のための不可欠な細胞プロセスです。興味深いことに、酸化ストレスはこれらのプロセスを変化させる可能性があり、したがって、転移がんなどの疾患の病態生理に貢献します。したがって、酸化還元状態の摂動中に細胞がECMにどのように付着および広がるかのメカニズムを理解することは、正常状態と疾患状態に関する洞察を提供することができます。以下で説明するのは、in vitroでフィブロネクチン（FN）上の不死化線維芽細胞の細胞接着と拡散を特異的に定量化するために免疫蛍光ベースのアッセイを利用する段階的なプロトコルです。簡単に言えば、アンカー依存性細胞は懸濁液に保持され、ATMキナーゼ阻害剤Ku55933にさらされて酸化ストレスを誘導します。次に、細胞をFNコーティングされた表面に播種し、所定の期間付着させます。付着したままの細胞は固定され、蛍光ベースの抗体マーカー（例：パキシリン）および拡散（例：F-アクチン）で標識されます。データの収集と分析は、過剰蛍光顕微鏡や自由に利用可能なフィジーソフトウェアなど、一般的に利用可能な実験装置を使用して実行されます。この手順は非常に用途が広く、さまざまな細胞株、ECMタンパク質、または阻害剤のために修正することができ、幅広い生物学的問題を調べることができます。

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the homeostasis of adult tissues. Interestingly, oxidative stress can alter these processes, thus contributing to the pathophysiology of diseases such as metastatic cancer. Therefore, understanding the mechanism(s) of how cells attach and spread on the ECM during perturbations in redox status can provide insight into normal and disease states. Described below is a step-wise protocol that utilizes an immunofluorescence-based assay to specifically quantify cell adhesion and spreading of immortalized fibroblast cells on fibronectin (FN) in vitro. Briefly, anchorage-dependent cells are held in suspension and exposed to the ATM kinase inhibitor Ku55933 to induce oxidative stress. Cells are then plated on FN-coated surface and allowed to attach for predetermined periods of time. Cells that remain attached are fixed and labeled with fluorescence-based antibody markers of adhesion (e.g., paxillin) and spreading (e.g., F-actin). Data acquisition and analysis are performed using commonly available laboratory equipment, including an epifluorescence microscope and freely available Fiji software. This procedure is highly versatile and can be modified for a variety of cell lines, ECM proteins, or inhibitors in order to examine a broad range of biological questions.