分泌ルシフェラーゼを発現するレプリコン細胞を使用したデング熱ウイルス複製の阻害剤の同定

デング熱ウイルス（DENV）は、デング熱（DF）、デング熱出血熱（DHF）、デング熱ショック症候群（DSS）の原因剤であり、熱帯および亜熱帯地域の公衆衛生問題であり続けています。ただし、現在、DENV感染に対する抗ウイルス治療はありません。この研究では、培養細胞の一定のウイルスRNAレプリケーションをサポートする安定したレポーターレプリコンセルシステムを開発することでした。分離されたレプリコン細胞は、細胞内のウイルスエンコードNS1、NS3、およびNS5タンパク質の発現と付随する培養上清において高レベルのルシフェラーゼ活性を示しました。NS1、NS3タンパク質、およびDSRNAは、免疫蛍光分析によりレプリコン細胞で検出されました。さらに、抗DENV阻害剤リバビリンとブロモクリプチンは、用量依存的にルシフェラーゼ活性を有意に減少させました。安定してトランスフェクトされたレプリコン細胞を使用した複合ライブラリを使用した高スループットスクリーニングは、0.57のZ因子値を示しました。私たちのスクリーニングでは、すでに抗DENV活性を示した1つの化合物を含むいくつかの候補者が得られました。まとめると、我々の結果は、分泌ルシフェラーゼ遺伝子を発現するこのDENVサブ遺伝子レプリコン細胞システムが、抗DENV化合物のハイスループットスクリーニングとDENV RNAの複製メカニズムの分析に役立つことを示しています。

Dengue virus (DENV) is the causative agent of dengue fever (DF), dengue haemorrhagic fever (DHF), and dengue shock syndrome (DSS) and continues to be a public health problem in the tropical and subtropical areas. However, there is currently no antiviral treatment for DENV infection. In this study, our aim was to develop a stable reporter replicon cell system that supports constant viral RNA replication in cultured cells. The isolated replicon cells exhibited high levels of luciferase activity in the culture supernatant concomitant with expression of virus-encoded NS1, NS3 and NS5 proteins in the cells. The NS1, NS3 proteins and dsRNA were detected in the replicon cells by immunofluorescence analysis. Furthermore, the anti-DENV inhibitors ribavirin and bromocriptine significantly reduced the luciferase activity in a dose-dependent manner. High-throughput screening with a compound library using the stably-transfected replicon cells showed a Z' factor value of 0.57. Our screening yielded several candidates including one compound that has already shown anti-DENV activity. Taken together, our results demonstrate that this DENV subgenomic replicon cell system expressing a secretory luciferase gene can be useful for the high-throughput screening of anti-DENV compounds and the analysis of the replication mechanism of the DENV RNA.