ラットおよびヒトニューロン培養のシナプスの自動ライブセルイメージング

シナプス損失および樹状突起損傷は、多くの神経変性疾患、神経発達障害の根底にある認知機能低下と相関し、環境および薬物誘発性CNS毒性に関連しています。ただし、ライブセル間のシナプス接続の損失を測定するために設計されたスクリーニングアッセイは不足しています。ここでは、自動シナプスイメージングアッセイ（アジア）の設計と検証について説明します。これは、ライブニューロン間のシナプスをラベル付け、画像化、分析するための効率的なアプローチです。ウイルス形質導入を使用して、シナプスと自動化されたコンピューター制御顕微鏡を標識する蛍光タンパク質を発現し、シナプス数を調節する薬剤を識別する方法を開発しました。アジアは、共焦点および広場顕微鏡の両方と互換性があります。広いフィールドの画像の獲得はより速いですが、分析のデコンボリューションステップが必要です。両方のタイプの画像は、ImageJ、CellProfiler、およびMetamorphプラットフォームで実行できるバッチ処理分析ソフトウェアにフィードします。一次分析エンドポイントは、構造シナプスの数と細胞生存率です。したがって、明白な細胞死は、シナプス密度の微妙な変化と区別されます。これは、神経変性プロセスを研究する際の重要な区別です。シナプス後密度95（PSD95）のクラスタリングを防ぐ化合物である100μM2-ブロモポールミチン酸（2-bp）で24時間処理したラット海馬培養では、アジアがシナプス後密度95増加緑色蛍光タンパク質（PSD95-GEEGFP）-LABELED SYNAPESの喪失を確実に検出しました。対照的に、100μMのグルタミン酸による治療は、共発現されたMCHERRYから作成されたバイナリイメージの形態学的変化から決定されるシナプス損失と重大な細胞死を引き起こしました。3 mMリチウムで24時間処理すると、蛍光乳頭の数が大幅に増加し、アジアもシナプス形成を検出することを示しています。概念実証研究は、細胞特異的プロモーターが抑制性または主要なニューロンの選択的研究を可能にし、代替レポーター構築がGABA作動性またはグルタミン酸作動性シナプスの定量化を可能にすることを示しています。アジアは、ヒト誘導多能性幹細胞（IPSC）由来の皮質ニューロン間のシナプス損失を研究するためにも使用できます。細胞死の非存在下で有意なシナプス損失は、100μM2-bpまたは100μMグルタミン酸で24時間処理したIPSC由来のニューロン培養で検出されましたが、300μMグルタミン酸はシナプス損失と細胞死を生成しました。アジアは、シナプス毒性を呼び起こす薬剤の識別と、シナプス損失を予防または逆転させる化合物のスクリーニングを示唆していることを示しています。

Synapse loss and dendritic damage correlate with cognitive decline in many neurodegenerative diseases, underlie neurodevelopmental disorders, and are associated with environmental and drug-induced CNS toxicities. However, screening assays designed to measure loss of synaptic connections between live cells are lacking. Here, we describe the design and validation of automated synaptic imaging assay (ASIA), an efficient approach to label, image, and analyze synapses between live neurons. Using viral transduction to express fluorescent proteins that label synapses and an automated computer-controlled microscope, we developed a method to identify agents that regulate synapse number. ASIA is compatible with both confocal and wide-field microscopy; wide-field image acquisition is faster but requires a deconvolution step in the analysis. Both types of images feed into batch processing analysis software that can be run on ImageJ, CellProfiler, and MetaMorph platforms. Primary analysis endpoints are the number of structural synapses and cell viability. Thus, overt cell death is differentiated from subtle changes in synapse density, an important distinction when studying neurodegenerative processes. In rat hippocampal cultures treated for 24 h with 100 μM 2-bromopalmitic acid (2-BP), a compound that prevents clustering of postsynaptic density 95 (PSD95), ASIA reliably detected loss of postsynaptic density 95-enhanced green fluorescent protein (PSD95-eGFP)-labeled synapses in the absence of cell death. In contrast, treatment with 100 μM glutamate produced synapse loss and significant cell death, determined from morphological changes in a binary image created from co-expressed mCherry. Treatment with 3 mM lithium for 24 h significantly increased the number of fluorescent puncta, showing that ASIA also detects synaptogenesis. Proof of concept studies show that cell-specific promoters enable the selective study of inhibitory or principal neurons and that alternative reporter constructs enable quantification of GABAergic or glutamatergic synapses. ASIA can also be used to study synapse loss between human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cortical neurons. Significant synapse loss in the absence of cell death was detected in the iPSC-derived neuronal cultures treated with either 100 μM 2-BP or 100 μM glutamate for 24 h, while 300 μM glutamate produced synapse loss and cell death. ASIA shows promise for identifying agents that evoke synaptic toxicities and screening for compounds that prevent or reverse synapse loss.