一本鎖DNAの迅速なin vitro産生

合成生物学、生物学的イメージング、およびバイオノテクノロジーにおいて、200ヌクレオチド> 200ヌクレオチド（NT）の一本鎖DNA（SSDNA）の需要が増加しています。スケーラビリティ、プロトコルステップの複雑さ、および/または収量における高純度の長いssDNAの直面の制限を生成するための既存の方法。少なくとも7つのキロベースまでの長さを持つ高純度SSDNAのin vitro生産のための迅速で高収量のユーザーフレンドリーな方法を紹介します。メタノール応答性ポリマーを持つ前方プライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（PCR）は、変性条件下で修飾鎖の選択的沈殿を可能にするタグ付きアンプリコンを生成します。SSDNAは、入力PCRアンプリコンに関して70％を超える収率で約40〜50分（PCR後の時間）で回収可能であることを示しています。回収されたssDNAは、ヒト細胞のCRISPR/CAS9相同性修復、DNA-Origami折りたたみ、蛍光in-situハイブリダイゼーションに使用できることを実証します。

There is increasing demand for single-stranded DNA (ssDNA) of lengths >200 nucleotides (nt) in synthetic biology, biological imaging and bionanotechnology. Existing methods to produce high-purity long ssDNA face limitations in scalability, complexity of protocol steps and/or yield. We present a rapid, high-yielding and user-friendly method for in vitro production of high-purity ssDNA with lengths up to at least seven kilobases. Polymerase chain reaction (PCR) with a forward primer bearing a methanol-responsive polymer generates a tagged amplicon that enables selective precipitation of the modified strand under denaturing conditions. We demonstrate that ssDNA is recoverable in ∼40-50 min (time after PCR) with >70% yield with respect to the input PCR amplicon, or up to 70 pmol per 100 μl PCR reaction. We demonstrate that the recovered ssDNA can be used for CRISPR/Cas9 homology directed repair in human cells, DNA-origami folding and fluorescent in-situ hybridization.