ヒストン後の修飾の定量的研究のためのネイティブ内部校正クロマチン免疫沈降

次世代シーケンス（CHIP-seq）と結合したクロマチン免疫沈降は、過去10年間のヒストン修飾の研究の中心的な方法として機能しました。CHIP-seq分析では、抗体は目的の修飾を伴うヌクレオソームを選択的に捕捉し、関連するDNAをゲノムにマッピングしてマークの分布を決定します。このアプローチにはいくつかの重要な欠点があります。（i）チップ解釈は、これがしばしばそうではないという証拠が高まっているにもかかわらず、完全な抗体特異性の仮定を必要とします。（ii）他の形式で抗体特異性を評価するための一般的な方法は、チップ実験内の特異性にほとんどまたはまったく関係がない。（iii）無効化されていないチップは相対濃縮として報告されます。これは、離散免疫沈降（IP）によって定義される実験的参照フレームの外側で生物学的に無意味であるため、実験的条件や修正全体で容易な比較を妨げます。（iv）次世代シーケンサーへの微分ライブラリの増幅とロード、および計算正規化は、サンプル間に存在する可能性のある定量的関係をさらに妥協する可能性があります。その結果、研究者には一連の潜在的な落とし穴が提示され、それらのほぼすべてに盲目です。ここでは、内部キャリブレーションチップ（Icechip）の詳細なプロトコルを提供します。これは、チップ手順内で定義された核質標準を急上昇させることにより、これらの問題を解決するために最近開発した方法です。このプロトコルは、特異性と定量的パワーのために最適化されており、抗体特異性の測定と、生物学的に意味のあるスケールでゲノム遺伝子座でのヒストン修飾密度（HMD）の絶対測定を可能にし、明確な比較を可能にします。次世代シーケンス（NGS）の最適条件とデータ分析の指示に関するガイダンスを提供します。このプロトコルには17〜18時間かかり、シーケンスまたはバイオインフォマティック分析の時間を除く。氷床の手順により、哺乳類細胞のヒストン後の翻訳後修飾（PTMS）ゲノム全体の正確な測定が可能になり、ショウジョウバエのメラノガスターとカエノルハブ炎エレガンスがより広く適していることを示しています。

Chromatin immunoprecipitation coupled to next-generation sequencing (ChIP-seq) has served as the central method for the study of histone modifications for the past decade. In ChIP-seq analyses, antibodies selectively capture nucleosomes bearing a modification of interest and the associated DNA is then mapped to the genome to determine the distribution of the mark. This approach has several important drawbacks: (i) ChIP interpretation necessitates the assumption of perfect antibody specificity, despite growing evidence that this is often not the case. (ii) Common methods for evaluating antibody specificity in other formats have little or no bearing on specificity within a ChIP experiment. (iii) Uncalibrated ChIP is reported as relative enrichment, which is biologically meaningless outside the experimental reference frame defined by a discrete immunoprecipitation (IP), thus preventing facile comparison across experimental conditions or modifications. (iv) Differential library amplification and loading onto next-generation sequencers, as well as computational normalization, can further compromise quantitative relationships that may exist between samples. Consequently, the researcher is presented with a series of potential pitfalls and is blind to nearly all of them. Here we provide a detailed protocol for internally calibrated ChIP (ICeChIP), a method we recently developed to resolve these problems by spike-in of defined nucleosomal standards within a ChIP procedure. This protocol is optimized for specificity and quantitative power, allowing for measurement of antibody specificity and absolute measurement of histone modification density (HMD) at genomic loci on a biologically meaningful scale enabling unambiguous comparisons. We provide guidance on optimal conditions for next-generation sequencing (NGS) and instructions for data analysis. This protocol takes between 17 and 18 h, excluding time for sequencing or bioinformatic analysis. The ICeChIP procedure enables accurate measurement of histone post-translational modifications (PTMs) genome-wide in mammalian cells as well as Drosophila melanogaster and Caenorhabditis elegans, indicating suitability for use in eukaryotic cells more broadly.