プロテアーゼの光学指紋と、フルオロフォア標識一本鎖DNAの異なる交差反応性によって提供されるそれらの阻害された複合体

阻害剤タンパク質を使用したプロテアーゼとその複合体の検出は、診断および医療治療用途にとって非常に重要です。この研究では、プロテアーゼの同定のために環境応答性の3'-カルボキシテトラメチルホダミン（TAMRA）で標識された一本鎖DNA（SSDNA）の配列を使用して、指紋ベースのセンサーを報告します。2つの異なるバッファー溶液に可溶化された異なる配列を持つ4つのTAMRA修飾SSDNAが、多様な交差反応性相互作用を通じてプロテアーゼに固有の蛍光フィンガープリントを生成できるアレイに組み込まれ、（i）8のプロテアーゼと（II）の識別を可能にします。多変量解析によるトリプシンとその阻害剤タンパク質（α1-アンチトリプシン）の異なる混合物。ヒトトロンビンのさまざまな部位に結合するタムラ修飾DNAアプタマーを使用してアレイを構築すると、ヒト血清の存在下でも、アントロンビンIIIとの錯体化時のトロンビンの露出表面積の減少を反映する蛍光フィンガープリントが提供されます。プロテアーゼの指紋情報を簡単に倍増する効果的な手段として、補完的なDNAとのハイブリダイゼーションの可能性を最終的に実証します。SSDNAの交差反応性能力に基づいた当社のアプローチにより、プロテアーゼを含むさまざまなタンパク質の識別だけでなく、その錯化能力の評価のために、柔軟に設計および簡単に構築できるハイスループットフィンガープリントベースのセンシングが可能になります。

The detection of proteases and their complexes with inhibitor proteins is of great importance for diagnosis and medical-treatment applications. In this study, we report a fingerprint-based sensor using an array of single-stranded DNAs (ssDNAs) labeled with environment-responsive 3'-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) for the identification of proteases. Four TAMRA-modified ssDNAs with different sequences solubilized in two different buffer solutions were incorporated in an array that was capable of generating fluorescent fingerprints unique to the proteases through diverse cross-reactive interactions, allowing the discrimination of (i) 8 proteases and (ii) 12 different mixtures of trypsin and its inhibitor protein (α1-antitrypsin) by multivariate analysis. Constructing an array with TAMRA-modified DNA aptamers that bind to different sites of human thrombin provides fluorescence fingerprints that reflect a reduction of the exposed surface area of thrombin upon complexation with antithrombin III, even in the presence of human serum. We finally demonstrate the potential of hybridization with complementary DNAs as an effective means to easily double the fingerprint information for proteases. Our approach based on the cross-reactive capability of ssDNAs enables high-throughput fingerprint-based sensing that can be flexibly designed and easily constructed, not only for the identification of a variety of proteins including proteases but also for the evaluation of their complexation ability.