DNAアセンブリと制限ライゲーションのクローニングを組み合わせたアデノウイルスベクターの部位指向修飾

一般的に使用され、よく受け入れられているアプローチは、アデノウイルスベクターの部位指向修正には不足しています。ここでは、ヒトアデノウイルス5（HADV-5）の感染性クローンであるPKAD5プラスミドから複製有能なアデノウイルスベクターシステムを確立する例を使用して、そのような目的のために簡単に実装しやすい戦略を導入しようとします。GFP発現カセットとプラスミド骨格のPCR産物を、DNAアセンブリにより修飾された中間プラスミドPMDXE3GAを生成するために、PKAD5のECORI/NDEI消化断片と融合しました。PMDXE3GAのNDEI染めのフラグメントをPKAD5に戻し、制限ライゲーションクローニングによりアデノウイルスプラスミドPKAD5XE3GAを形成しました。組換えアデノウイルスHADV5-XE3GAを救助し、増幅し、精製しました。接着性HEP-2および懸濁液K562細胞におけるGFPの発現とウイルスの伝播を調査しました。標的遺伝子の発現は、ウイルスの複製によりHadV5-XE3GAに感染した両方の細胞株で有意に増強されました。ただし、ウイルスの伝播は、K562細胞の培養では維持できませんでした。シャトルプラスミドPSH5RC-GFPは、導入遺伝子の交換を促進するために構築されました。要約すると、DNAアセンブリと制限ライゲーションクローニングの組み合わせの戦略は、機能的で費用対効果が高く、アデノウイルスの遺伝的修飾に適しています。

Commonly used and well accepted approaches are lacking for site-directed modification of adenoviral vectors. Here, we attempt to introduce an easy-to-implement strategy for such purpose with an example of establishing a replication competent adenoviral vector system from pKAd5 plasmid, an infectious clone of human adenovirus 5 (HAdV-5). PCR products of GFP expression cassette and plasmid backbone were fused with the EcoRI/NdeI-digested fragment of pKAd5 to generate a modified intermediate plasmid pMDXE3GA by DNA assembly. NdeI-digested fragment of pMDXE3GA was brought back to pKAd5 to form the adenoviral plasmid pKAd5XE3GA by restriction-ligation cloning. Recombinant adenovirus HAdV5-XE3GA was rescued, amplified and purified. The expression of GFP and the propagation of virus in adherent HEp-2 and suspension K562 cells were investigated. Expression of target gene was significantly enhanced in both cell lines infected with HAdV5-XE3GA due to virus replication. However, propagation of virus could not sustain in culture of K562 cells. Shuttle plasmid pSh5RC-GFP was constructed to facilitate exchange of transgene. In summary, the strategy of combined DNA assembly and restriction-ligation cloning is functional, cost-effective and suitable for genetic modification of adenovirus.