HNF4は脂肪酸酸化を調節し、マウスの腸幹細胞の更新に必要です

背景と目的：腸幹細胞（ISC）の機能は、食事と代謝経路によって調節されます。肝細胞核因子4（HNF4）ファミリーは、脂肪酸を結合する転写因子です。HNF4転写因子がマウスのISCにおける代謝とその機能をどのように調節するかを調査しました。 方法：villin-creert2; lgr5-egfp-ires-creert2;hnf4αf/f;hnf4γcrispr/crisprマウスで研究を行いました。マウスにタモキシフェンを投与して、CREリコンビナーゼを誘導しました。CRE対立遺伝子のみを含むトランスジェニック（Villin-Creert2、LGR5-EGFP-ARES-CREERT2、HNF4α+/+、およびHNF4γ+/+）または投与されたマウスをコントロールとして使用しました。地下室と絨毛細胞を分離し、蛍光標識脂肪酸またはグルコース類似体とインキュベートし、共焦点顕微鏡で分析しました。脂肪酸酸化活性とトリカルボン酸（TCA）サイクル代謝産物は、HNF4αγDKOの小腸の近位半分から収集された細胞で測定され、コントロールマウスが測定されました。クロマチン免疫沈降と遺伝子発現プロファイリング分析を実施して、HNF4因子によって調節される遺伝子を特定しました。十二指腸窩からオルガノイドを確立し、標識パルミチン酸またはアセテートとインキュベートし、TCAサイクル代謝産物または脂肪酸の産生を測定しました。アセテート、アセチルコエンザイムA（COA）（脂肪酸β酸化の産物[FAO]）またはジクロロ酢酸は、ピルビン酸酸化とミトコンドリアアセチルCOAの生成を促進する化合物であるジクロロ酢酸を代謝介入に使用しました。 結果：クリプト細胞は、標識脂肪酸を急速に吸収し、LGR5+幹細胞マーカー（LGR5、OLFM4、SMOC2、MSI1、およびASCL2）のメッセンジャーRNAレベルをFAOの阻害剤であるエトモキシルでインキュベートしたオルガノイドでダウンレギュレートし、FAOがそのことを示しています。ISCの更新に必要です。HNF4AおよびHNF4Gは、ISCで発現し、腸上皮全体で発現しました。HNF4AまたはHNF4Gの単一ノックアウトはISCの維持に影響しませんでしたが、HNF4AとHNF4GのダブルノックアウトはISCの損失をもたらしました。幹細胞は更新に失敗しました。FAOはISCの更新をサポートし、HNF4転写因子は、ACSL5およびACSF2（アシルCoA合成のエンコード調節因子）、SLC27A2（脂肪酸輸送体をエンコード）、FABP2（脂肪酸結合タンパク質をエンコード）、およびHadH（エンコードハド（エンコード）を含むFAO遺伝子を直接活性化します。ヒドロキシアシル-CoAデヒドロゲナーゼ）。HNF4αγDKOマウスの腸上皮では、FAO遺伝子の発現レベル、FAO活性、およびTCAサイクルの代謝物がすべて大幅に減少しましたが、対照マウスと比較して脂肪酸合成転写産物が増加しました。TCAサイクルへの標識されたパルミチン酸またはアセテートの寄与は、対照マウスと比較して、HNF4αγDKOマウスに由来するオルガノイドで減少しました。酢酸またはジクロロ酢酸を含む二重ノックアウトマウスに由来するオルガノイドのインキュベーション復元された幹細胞。 結論：マウスでは、転写因子HNF4AおよびHNF4GはFAOに必要な遺伝子の発現を調節し、ISCの更新に必要です。

BACKGROUND & AIMS: Functions of intestinal stem cells (ISCs) are regulated by diet and metabolic pathways. Hepatocyte nuclear factor 4 (HNF4) family are transcription factors that bind fatty acids. We investigated how HNF4 transcription factors regulate metabolism and their functions in ISCs in mice. METHODS: We performed studies with Villin-CreERT2;Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2;Hnf4αf/f;Hnf4γCrispr/Crispr mice, hereafter referred to Hnf4αγDKO. Mice were given tamoxifen to induce Cre recombinase. Mice transgenic with only Cre alleles (Villin-CreERT2, Lgr5-EGFP-IRES-CreERT2, Hnf4α+/+, and Hnf4γ+/+) or mice given vehicle were used as controls. Crypt and villus cells were isolated, incubated with fluorescently labeled fatty acids or glucose analog, and analyzed by confocal microscopy. Fatty acid oxidation activity and tricarboxylic acid (TCA) cycle metabolites were measured in cells collected from the proximal half of the small intestine of Hnf4αγDKO and control mice. We performed chromatin immunoprecipitation and gene expression profiling analyses to identify genes regulated by HNF4 factors. We established organoids from duodenal crypts, incubated them with labeled palmitate or acetate, and measured production of TCA cycle metabolites or fatty acids. Acetate, a precursor of acetyl coenzyme A (CoA) (a product of fatty acid β-oxidation [FAO]), or dichloroacetate, a compound that promotes pyruvate oxidation and generation of mitochondrial acetyl-CoA, were used for metabolic intervention. RESULTS: Crypt cells rapidly absorbed labeled fatty acids, and messenger RNA levels of Lgr5+ stem cell markers (Lgr5, Olfm4, Smoc2, Msi1, and Ascl2) were down-regulated in organoids incubated with etomoxir, an inhibitor of FAO, indicating that FAO was required for renewal of ISCs. HNF4A and HNF4G were expressed in ISCs and throughout the intestinal epithelium. Single knockout of either HNF4A or HNF4G did not affect maintenance of ISCs, but double-knockout of HNF4A and HNF4G resulted in ISC loss; stem cells failed to renew. FAO supports ISC renewal, and HNF4 transcription factors directly activate FAO genes, including Acsl5 and Acsf2 (encode regulators of acyl-CoA synthesis), Slc27a2 (encodes a fatty acid transporter), Fabp2 (encodes fatty acid binding protein), and Hadh (encodes hydroxyacyl-CoA dehydrogenase). In the intestinal epithelium of Hnf4αγDKO mice, expression levels of FAO genes, FAO activity, and metabolites of TCA cycle were all significantly decreased, but fatty acid synthesis transcripts were increased, compared with control mice. The contribution of labeled palmitate or acetate to the TCA cycle was reduced in organoids derived from Hnf4αγDKO mice, compared with control mice. Incubation of organoids derived from double-knockout mice with acetate or dichloroacetate restored stem cells. CONCLUSIONS: In mice, the transcription factors HNF4A and HNF4G regulate the expression of genes required for FAO and are required for renewal of ISCs.