蛍光顕微鏡を使用したマイコプラズマを検出するための新しい敏感な方法

マイコプラズマによる細胞培養の汚染は、非常に一般的な現象です。彼らは細胞の代謝を大幅に変更し、実験室のすべての細胞培養に潜在的に広がる可能性があるため、それらの早期発見が必要です。マイコプラズマ検出の最も速く安価な方法の1つは、DAPIまたはHoechst染料によるマイコプラズマのDNAの直接染色に依存しています。この方法は実行が簡単で速いですが、核DNAと比較してこれらの染料によって提供される低いシグナルに苦しんでいます。したがって、レポーター細胞株は、DAPIまたはHoechst染色ステップの前のマイコプラズマの栽培に使用されます。提示された研究では、マイコプラズマの検出のための新しい免疫蛍光アッセイを開発およびテストしました。この方法は、DNAポリメラーゼIを使用した酵素標識と、マイコプラズマのDNAでニックを利用した修飾ヌクレオチドに基づいています。修飾されたヌクレオチドは、マイコプラズマのDNAに組み込まれ、その後免疫蛍光顕微鏡によって視覚化されます。開発されたアプローチは、マイコプラズマ株とは無関係であり、核DNAを強く染色せず、他の細菌を染色せず、DAPIまたはHoechst染料を使用した直接標識に基づくアプローチよりも高い感度を提供します。

Contamination of cell cultures by mycoplasmas is a very common phenomenon. As they can substantially alter cell metabolism and potentially spread to all cell cultures in laboratory, their early detection is necessary. One of the fastest and cheapest methods of mycoplasma detection relies on the direct staining of mycoplasmas' DNA by DAPI or Hoechst dyes. Although this method is easy and fast to perform, it suffers from the low signal provided by these dyes compared to the nuclear DNA. Therefore, the reporter cell lines are used for cultivation of mycoplasmas before DAPI or the Hoechst staining step. In the study presented, we have developed and tested a new immunofluorescence assay for the detection of mycoplasmas. The method is based on the enzymatic labeling using DNA polymerase I and modified nucleotides utilizing nicks in the mycoplasmas' DNA. Modified nucleotides are incorporated into mycoplasmas' DNA and subsequently visualized by immunofluorescence microscopy. The developed approach is independent of the mycoplasma strain, does not intensely stain nuclear DNA, does not stain other bacteria, and provides higher sensitivity than the approach based on the direct labeling using DAPI or Hoechst dyes.