複製転写複合体へのヌクレオカプシドタンパク質の動員は、冠波のライフサイクルで重要な役割を果たします

コロナウイルス（COV）ヌクレオカプシド（N）タンパク質は、ゲノムRNAを子孫ウイルス粒子に組み込むための鍵です。感染した細胞では、Nタンパク質がCOV RNA合成の部位である複製転写複合体（RTC）に存在します。Nタンパク質はウイルス複製にとって重要であり、一般的に使用されるモデルCOVであるマウス肝炎ウイルス（MHV）の1つが、RTCの成分である非構造タンパク質3（NSP3）と相互作用することが示されています。ただし、COVライフサイクルのこれら2つの側面はリンクされていません。MHV Nタンパク質は、系統的な酵母2ハイブリッドアプローチを使用して他のRTC成分ではなくNSP3にのみ結合することがわかり、この相互作用を冗長に媒介するNタンパク質の2つの異なる領域を特定しました。これら2つの領域の選択的Nタンパク質バリアントのキャリングポイント変異は、in vitroでNSP3に結合することができず、さらにin vivoでのRTCへの動員が阻害されます。野生型Nタンパク質とは対照的に、このNタンパク質変異はゲノムの刺激を損ないますin vivoおよびin vitroでのRNAおよびウイルスmRNA転写は、MHV複製と子孫の産生の障害につながります。全体として、我々の結果は、NSP3への結合を介してRTCへのNタンパク質の動員が、最適なウイルスRNA合成にとって重要であるため、COVライフサイクルの重要なステップであることを示しています。しかし、重度の急性呼吸器症候群COVおよび中東呼吸器症候群COVによって引き起こされる重度の呼吸器感染発生により、ヒトの病原性と死亡率が高くなりました。これらの発生は、COV感染を制御できることの関連性を強調しました。モデルCOV、MHVを使用して、COVビリオンの中心成分であるNタンパク質の動員の重要性を調査し、COVがゲノムを複製、転写、翻訳する細胞内プラットフォームになりました。これらの細胞内プラットフォームで主要な結合パートナーを特定し、特定の変異体を生成することにより、これらの場所へのNタンパク質の動員がウイルスRNA合成を促進するために重要であることがわかりました。さらに、この募集をブロックすると、ウイルス感染が強く阻害されます。したがって、我々の結果は、COVライフサイクルの重要な側面を説明し、抗ウイルス療法で標的とする可能性のあるウイルスタンパク質の相互作用を明らかにします。

Coronavirus (CoV) nucleocapsid (N) proteins are key for incorporating genomic RNA into progeny viral particles. In infected cells, N proteins are present at the replication-transcription complexes (RTCs), the sites of CoV RNA synthesis. It has been shown that N proteins are important for viral replication and that the one of mouse hepatitis virus (MHV), a commonly used model CoV, interacts with nonstructural protein 3 (nsp3), a component of the RTCs. These two aspects of the CoV life cycle, however, have not been linked. We found that the MHV N protein binds exclusively to nsp3 and not other RTC components by using a systematic yeast two-hybrid approach, and we identified two distinct regions in the N protein that redundantly mediate this interaction. A selective N protein variant carrying point mutations in these two regions fails to bind nsp3 in vitro, resulting in inhibition of its recruitment to RTCs in vivo Furthermore, in contrast to the wild-type N protein, this N protein variant impairs the stimulation of genomic RNA and viral mRNA transcription in vivo and in vitro, which in turn leads to impairment of MHV replication and progeny production. Altogether, our results show that N protein recruitment to RTCs, via binding to nsp3, is an essential step in the CoV life cycle because it is critical for optimal viral RNA synthesis.IMPORTANCE CoVs have long been regarded as relatively harmless pathogens for humans. Severe respiratory tract infection outbreaks caused by severe acute respiratory syndrome CoV and Middle East respiratory syndrome CoV, however, have caused high pathogenicity and mortality rates in humans. These outbreaks highlighted the relevance of being able to control CoV infections. We used a model CoV, MHV, to investigate the importance of the recruitment of N protein, a central component of CoV virions, to intracellular platforms where CoVs replicate, transcribe, and translate their genomes. By identifying the principal binding partner at these intracellular platforms and generating a specific mutant, we found that N protein recruitment to these locations is crucial for promoting viral RNA synthesis. Moreover, blocking this recruitment strongly inhibits viral infection. Thus, our results explain an important aspect of the CoV life cycle and reveal an interaction of viral proteins that could be targeted in antiviral therapies.