チロシン73およびセリン83 H1N1インフルエンザウイルスNS1タンパク質の豚豚の脱リン酸化は、ウイルスの複製を減衰させ、高レベルのベータインターフェロンを誘導します

背景：非構造タンパク質1（NS1）は、感染症の初期段階で宿主細胞の核と細胞質で発現するインフルエンザAウイルス（IAV）によってコードされる毒性因子です。NS1は、ウイルスの複製、病原性、宿主抗ウイルス免疫応答の阻害に重要な役割を果たす多機能タンパク質です。しかし、これまで、NS1のリン酸化部位は特定されておらず、リン酸化とタンパク質機能の関係は完全には解明されていません。 方法：この研究では、豚インフルエンザウイルス（SIV）NS1タンパク質の潜在的なリン酸化部位は、PHOS-TAG SDS-PAGE分析によって生体内性に予測および決定されました。NS1リン酸化部位の役割を研究するために、A/豚/上海/2014年3月（H1N1）株のNS1変異体（Y73FおよびS83A）を救助し、培養細胞の細胞内局在と同様に複製能力、サイトカイン産生、および細胞内局在を比較しました。さらに、小さな干渉RNA（siRNA）アッセイを使用して、位置73および83での脱リン酸化によるI型IFN応答の変化がRIG-I経路によって媒介されたかどうかを調査しました。 結果：30のSIV NS1遺伝子の18の予測部位をチェックして、H1N1、H1N2、およびH3N2サブタイプをカバーし、PHOS-TAG SDS-PAGE分析によりH1N1 SIVタンパク質の2つのリン酸化部位Y73およびS83を識別し、株固有の部位を除外しました。NS1タンパク質の位置73および83での脱リン酸化は、ウイルスの複製を減衰させ、NS1のIFN-β発現に拮抗する能力を低下させたが、核局在化には影響しないことがわかりました。RIG-Iのノックダウンは、NS1 Y73FまたはS83A変異感に感染した細胞でのIFN-βおよびISG56の誘導を劇的に損ない、RIG-IがRSIV NS1 Y73FおよびRSIV NS1 S83A感染においてIFN-β応答に役割を果たすことを示しています。 結論：最初にH1N1 SIVタンパク質の2つの機能性リン酸化部位を特定しました：Y73およびS83。NS1タンパク質の位置73および83の脱リン酸化が、一部はRIG-I経路を介して宿主細胞の抗ウイルス状態に影響を与えることがわかりました。

BACKGROUND: Nonstructural protein 1 (NS1) is a virulence factor encoded by influenza A virus (IAV) that is expressed in the nucleus and cytoplasm of host cells during the earliest stages of infection. NS1 is a multifunctional protein that plays an important role in virus replication, virulence and inhibition of the host antiviral immune response. However, to date, the phosphorylation sites of NS1 have not been identified, and the relationship between phosphorylation and protein function has not been thoroughly elucidated. METHOD: In this study, potential phosphorylation sites in the swine influenza virus (SIV) NS1 protein were bioinformatically predicted and determined by Phos-tag SDS-PAGE analysis. To study the role of NS1 phosphorylation sites, we rescued NS1 mutants (Y73F and S83A) of A/swine/Shanghai/3/2014(H1N1) strain and compared their replication ability, cytokine production as well as the intracellular localization in cultured cells. Additionally, we used small interfering RNA (siRNA) assay to explore whether changes in the type I IFN response with dephosphorylation at positions 73 and 83 were mediated by the RIG-I pathway. RESULTS: We checked 18 predicted sites in 30 SIV NS1 genes to exclude strain-specific sites, covering H1N1, H1N2 and H3N2 subtypes and identified two phosphorylation sites Y73 and S83 in the H1N1 SIV protein by Phos-tag SDS-PAGE analysis. We found that dephosphorylation at positions 73 and 83 of the NS1 protein attenuated virus replication and reduced the ability of NS1 to antagonize IFN-β expression but had no effect on nuclear localization. Knockdown of RIG-I dramatically impaired the induction of IFN-β and ISG56 in NS1 Y73F or S83A mutant-infected cells, indicating that RIG-I plays a role in the IFN-β response upon rSIV NS1 Y73F and rSIV NS1 S83A infection. CONCLUSION: We first identified two functional phosphorylation sites in the H1N1 SIV protein: Y73 and S83. We found that dephosphorylation at positions 73 and 83 of the NS1 protein affected the antiviral state in the host cells, partly through the RIG-I pathway.