2Dゲル電気泳動ベースのプロテオーム全体のCETSAを使用したPKM2調節シグナル伝達を標的とする小さな化合物の同定

細胞熱シフトアッセイ（CETSA）は最近、小さな化合物の標的検証と、化合物との結合によるタンパク質の熱安定化または不安定化を監視するためのラベルフリーの方法として考案されました。ここでは、2Dゲル電気泳動、つまり2DE-CETSAに基づいてCETSAとプロテオミクス分析を組み合わせて、新しい化合物と結合することにより熱安定性シフトタンパク質を特定することにより、修正された方法を開発しました。2DE-CETSAを標的と知られていない化合物NPD10084の分析に適用しました。これは、in vitroおよびin vivoで結腸直腸癌細胞に対する抗増殖活性を発揮し、候補標的タンパク質としてピルビン酸キナーゼ筋肉2（PKM2）を同定しました。興味深いことに、NPD10084は、PKM2とβ-カテニンまたはSTAT3の間のタンパク質間相互作用を中断し、その後下流シグナル伝達の抑制を行いました。したがって、2DE-CETSAメソッドは、表現型スクリーニングによって発見された標的化合物の識別に適用できることを実証します。

The cellular thermal shift assay (CETSA) has recently been devised as a label-free method for target validation of small compounds and monitoring the thermal stabilization or destabilization of proteins due to binding with the compound. Herein, we developed a modified method by combining the CETSA and proteomics analysis based on 2D gel electrophoresis, namely 2DE-CETSA, to identify the thermal stability-shifted proteins by binding with a new compound. We applied the 2DE-CETSA for analysis of a target-unknown compound, NPD10084, which exerts anti-proliferative activity against colorectal cancer cells in vitro and in vivo, and identified pyruvate kinase muscle isoform 2 (PKM2) as a candidate target protein. Interestingly, NPD10084 interrupted protein-protein interactions between PKM2 and β-catenin or STAT3, with subsequent suppression of downstream signaling. We thus demonstrate that our 2DE-CETSA method is applicable for identification of target compounds discovered by phenotypic screening.