残基146での変異の表現型分析は、NS5A過リン酸化とC型肝炎ウイルスゲノム複製との関係に関する洞察を提供します。

C型肝炎ウイルス遺伝子型2a分離株JFH-1は、他の分離株よりもはるかに効率的なゲノム複製を示しています。基本的な複製メカニズムは保存する必要がありますが、これにより、複製の調節が隔離および/または遺伝子型固有の特性を示す可能性があるかどうかの問題が生じます。これを例示すると、NS5A過剰リン酸化の表現型は遺伝子型依存性です。遺伝子型1bでは、過リン酸化の喪失は複製の増強と相関しています。対照的に、JFH-1の複製は、高リン酸化によって調節されていません。以前、JFH-1 NS5A：S146の新しいリン酸化部位を特定しました。リン模倣置換（S146D）は複製に影響を与えませんでしたが、高リン酸化の喪失と相関していました。遺伝子型1bでは、残基146はアラニンであるため、A146をリン酸化可能な（S）、またはリン酸化型で置換するか、残基がJFH-1表現型を再現し、繰り返しの高リン酸化を再現するかどうかを調査しました。A146Dは、複製複合体の周核制限、脂質液滴の減少とPI4P脂質蓄積の減少、およびNS5A二量体の破壊を伴う、過剰リン酸化の喪失と複製の減少の両方を示したため、そうではありませんでした。対照的に、低複雑度シーケンスI（LCSI）のS232i培養適応変異も高リン酸化の喪失を示しましたが、複製の増加に関連していました。まとめると、これらのデータは、過剰リン酸化が複製を直接調節しないことを意味します。対照的に、高リン酸化の喪失は、ゲノム複製とNS5a機能の摂動の結果です。さらに、NS5aのドメインIまたはLCSIのいずれかの変異が過剰リン酸化を破壊し、複数のパラメーターがNS5aのリン酸化状態に影響することを示していることを示しています。

The hepatitis C virus genotype 2a isolate, JFH-1, exhibits much more efficient genome replication than other isolates. Although basic replication mechanisms must be conserved, this raises the question of whether the regulation of replication might exhibit isolate- and/or genotype-specific characteristics. Exemplifying this, the phenotype of NS5A hyperphosphorylation is genotype-dependent; in genotype 1b a loss of hyperphosphorylation correlates with an enhancement of replication. In contrast, the replication of JFH-1 is not regulated by hyperphosphorylation. We previously identified a novel phosphorylation site in JFH-1 NS5A: S146. A phosphomimetic substitution (S146D) had no effect on replication but correlated with a loss of hyperphosphorylation. In genotype 1b, residue 146 is alanine and we therefore investigated whether the substitution of A146 with a phosphorylatable (S), or phosphomimetic, residue would recapitulate the JFH-1 phenotype, decoupling hyperphosphorylation from replication. This was not the case, as A146D exhibited both a loss of hyperphosphorylation and a reduction in replication, accompanied by a perinuclear restriction of replication complexes, reductions in lipid droplet and PI4P lipid accumulation, and a disruption of NS5A dimerization. In contrast, the S232I culture-adaptive mutation in the low-complexity sequence I (LCSI) also exhibited a loss of hyperphosphorylation, but was associated with an increase in replication. Taken together, these data imply that hyperphosphorylation does not directly regulate replication. In contrast, the loss of hyperphosphorylation is a consequence of perturbing genome replication and NS5A function. Furthermore, we show that mutations in either domain I or LCSI of NS5A can disrupt hyperphosphorylation, demonstrating that multiple parameters influence the phosphorylation status of NS5A.