DNA依存性プロテインキナーゼは、リソソームAMP依存性プロテインキナーゼの活性化とオートファジーを調節します

マクロオートファジー/オートファジーは、細胞保護細胞ストレス応答の中心的な成分です。ストレス誘発性オートファジーシグナル伝達を啓発するために、MCF7ヒト乳がん細胞のオートファジーフラックスの調節因子についてヒトキノムsiRNAライブラリをスクリーニングし、DNA依存性プロテインキナーゼPRKDC/DNA-PKCの触媒サブユニットを基底およびDNAの陽性レギュレーターとして同定しました。損傷誘発オートファジー。AMP依存性プロテインキナーゼ（AMPK）複合体およびULK1キナーゼの上流にPRKDCを配置したオートファジー調節シグナル伝達カスケードの分析。正常な培養条件では、PRKDCはAMPK複合体と相互作用し、そのヌクレオチドセンシングγ1サブユニットPRKAG1/AMPKγ1でSer192およびThr284をリン酸化し、両方のイベントがAMPK錯体の活性化により大幅に減少しました。PRKAG1のPRKDCリン酸化部位のアラニン置換は、ヌクレオチド検知能力に影響を与えることなくAMPK複合体の活性化を減少させました。代わりに、PRKAG1のPRKDCを介したリン酸化の妨害は、AMPK複合体のリソソーム局在化とSTK11との飢starによる関連性を阻害しました（セリン/スレオニンキナーゼ11）。まとめると、我々のデータは、PRKAG1プライムAMPK複合体のPRKDCを介したリン酸化が癌細胞におけるSTK11によるリソソーム活性化に対するリソソーム活性化に、それによりオートファジーおよび細胞代謝に対するDNA損傷応答をリンクすることを示唆しています。略語：axin1：axin 1;3-MA：3-メチルアデニン;5-FU：5-フルオロウラシル;AA変異体：Prkag1の二重アラニン変異体（S192A、T284A）。ACACA：アセチルCoAカルボキシラーゼアルファ;AICAR：5-アミノイミダゾール-4-カルボキサミドリボヌクレオチド;AMPK：AMP活性化プロテインキナーゼ。ATG：オートファジー関連;ATM：毛細血圧症が変異した。ATR：ATMセリン/スレオニンキナーゼ;AV：オートファジー液胞;AVD：分解性オートファジー液胞;AVI：初期オートファジー液胞;Becn1：Beclin 1;BSA：ウシ血清アルブミン。CBS：シスタチオニンベータシンサゼ;CDK7：サイクリン依存性キナーゼ7;CDKN1A：サイクリン依存性キナーゼ阻害剤1A;EGFP：強化された緑色蛍光タンパク質。GAPDH：グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ;GST：グルタチオンSトランスフェーゼ。H2AX/H2AFX：H2A.Xバリアントヒストン。HBSS：ハンクスバランスのとれた塩溶液。IP：免疫積分;IR：電離放射線;MAP1LC3/LC3：微小管関連タンパク質1軽鎖3;MAP3K9：マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ9;MRFP：単量体赤色蛍光タンパク質。MCH：MCHERRY;MCM7：ミニクロモソーム維持複合コンポーネント7;MTORC1：ラパマイシンキナーゼ複合体1の機械的標的1;NHEJ：非相対的な結合。NRBP2：核受容体結合タンパク質2;NTC：非ターゲティングコントロール。Nuak1：Nuakファミリーキナーゼ1;PBS：リン酸緩衝生理食塩水;PIK3AP1：ホスホイノシチド-3-キナーゼアダプタータンパク質1;PIK3CA：ホスファチジルイノシトール-4,5-ビプリン酸3-キナーゼ触媒サブユニットアルファ;Pikk：ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ関連キナーゼ。PRKAA：プロテインキナーゼAMP活性化触媒サブユニットアルファ。PRKAB：プロテインキナーゼAMP活性化非触媒サブユニットベータ。PRKAG：プロテインキナーゼAMP活性化非触媒サブユニットガンマ。PRKDC：プロテインキナーゼ、DNA活性化、触媒サブユニット。RLUC：レニーラルシフェラーゼ;RPS6KB1：リボソームタンパク質S6キナーゼB1;SQSTM1：SemeStosome 1;STK11/LKB1：セリン/スレオニンキナーゼ11;TP53：腫瘍タンパク質P53;TSKS：精巣固有のセリンキナーゼ基質;ULK1：UNC-51のようなオートファジー活性化キナーゼ1;WIPI2：WD繰り返しドメイン、ホスホイノシチド相互作用2。WT：野生型。

Macroautophagy/autophagy is a central component of the cytoprotective cellular stress response. To enlighten stress-induced autophagy signaling, we screened a human kinome siRNA library for regulators of autophagic flux in MCF7 human breast carcinoma cells and identified the catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase PRKDC/DNA-PKcs as a positive regulator of basal and DNA damage-induced autophagy. Analysis of autophagy-regulating signaling cascades placed PRKDC upstream of the AMP-dependent protein kinase (AMPK) complex and ULK1 kinase. In normal culture conditions, PRKDC interacted with the AMPK complex and phosphorylated its nucleotide-sensing γ1 subunit PRKAG1/AMPKγ1 at Ser192 and Thr284, both events being significantly reduced upon the activation of the AMPK complex. Alanine substitutions of PRKDC phosphorylation sites in PRKAG1 reduced AMPK complex activation without affecting its nucleotide sensing capacity. Instead, the disturbance of PRKDC-mediated phosphorylation of PRKAG1 inhibited the lysosomal localization of the AMPK complex and its starvation-induced association with STK11 (serine/threonine kinase 11). Taken together, our data suggest that PRKDC-mediated phosphorylation of PRKAG1 primes AMPK complex to the lysosomal activation by STK11 in cancer cells thereby linking DNA damage response to autophagy and cellular metabolism. Abbreviations: AXIN1: axin 1; 3-MA: 3-methyladenine; 5-FU: 5-fluorouracil; AA mutant: double alanine mutant (S192A, T284A) of PRKAG1; ACACA: acetyl-CoA carboxylase alpha; AICAR: 5-Aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide; AMPK: AMP-activated protein kinase; ATG: autophagy-related; ATM: ataxia telangiectasia mutated; ATR: ATM serine/threonine kinase; AV: autophagic vacuole; AVd: degradative autophagic vacuole; AVi: initial autophagic vacuole; BECN1: beclin 1; BSA: bovine serum albumin; CBS: cystathionine beta-synthase; CDK7: cyclin dependent kinase 7; CDKN1A: cyclin dependent kinase inhibitor 1A; EGFP: enhanced green fluorescent protein; GAPDH: glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase; GST: glutathione S transferase; H2AX/H2AFX: H2A.X variant histone; HBSS: Hanks balanced salt solution; IP: immunopurification; IR: ionizing radiation; MAP1LC3/LC3: microtubule associated protein 1 light chain 3; MAP3K9: mitogen-activated protein kinase kinase kinase 9; mRFP: monomeric red fluorescent protein; mCh: mCherry; MCM7: minichromosome maintenance complex component 7; MTORC1: mechanistic target of rapamycin kinase complex 1; NHEJ: non-homologous end joining; NRBP2: nuclear receptor binding protein 2; NTC: non-targeting control; NUAK1: NUAK family kinase 1; PBS: phosphate-buffered saline; PIK3AP1: phosphoinositide-3-kinase adaptor protein 1; PIK3CA: phosphatidylinositol-4,5-biphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha; PIKK: phosphatidylinositol 3-kinase-related kinase; PRKAA: protein kinase AMP-activated catalytic subunit alpha; PRKAB: protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit beta; PRKAG: protein kinase AMP-activated non-catalytic subunit gamma; PRKDC: protein kinase, DNA-activated, catalytic subunit; RLuc: Renilla luciferase; RPS6KB1: ribosomal protein S6 kinase B1; SQSTM1: sequestosome 1; STK11/LKB1: serine/threonine kinase 11; TP53: tumor protein p53; TSKS: testis specific serine kinase substrate; ULK1: unc-51 like autophagy activating kinase 1; WIPI2: WD repeat domain, phosphoinositide interacting 2; WT: wild type.