[非アルコール性脂肪肝疾患の細胞モデルにおけるアポトーシスおよび酸化ストレスのミトコンドリア経路に対するメトホルミンの効果]

目的：非アルコール性脂肪肝疾患の細胞モデルにおけるアポトーシスおよび酸化ストレスのミトコンドリア経路に対するメトホルミンの効果を調査する。方法：非アルコール性脂肪肝疾患のin vitro細胞モデルは、0.6 mmol/Lオレイン酸を使用してHepG2細胞に脂質蓄積を誘導しました。HEPG2細胞をコントロール（CON）グループ、オレイン酸（OA）グループ、およびメトホルミン低（1mmol/L）および高（10mmol/L）用量基に分割しました。オイルレッドO染色を使用して、細胞内脂質液滴分布を検出しました。培養上清中のアラニンアミノトランスフェラーゼとアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼのレベルは、アッセイキットによって検出されました。DCFH-DA法を使用して、HepG2細胞の反応性酸素種を検出しました。二重染色フローサイトメトリーを使用して、HEPG2細胞のアポトーシス率を検出しました。ウエスタンブロットを使用して、カスパーゼ-3、B-リンパ球リンパ腫関連タンパク質、B細胞リンパ腫2、およびシトクロムCタンパク質を検出しました。一元配置分析を使用して、グループ間のデータを比較しました。結果：オレイン酸誘発HEPG2細胞は、脂質液滴とともに有意に増加しました。低および高用量のメトホルミンは、細胞内脂質液滴の蓄積を減少させました。高用量群におけるメトホルミンの効果は、低用量群の効果よりも重要でした。OA群のHepG2細胞におけるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼは、それぞれ（43.41±7.11）U/Lおよび（29.56±4.11）U/Lでした。細胞内アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニンアミノトランスフェラーゼは、低および高用量メトホルミンでの処理後、（32.44±4.08）U/L、（19.31±3.03）U/L、（26.00±3.11）U/Lおよび（（15.11±4.11）U/L、差は統計的に有意でした（P <0.05）。DCFH-DAテスト結果は、オレイン酸グループの反応性酸素種の蛍光強度が41.21％±4.23％であることを示し、一方、低用量および高用量メトホルミン基の反応性酸素種の蛍光強度は27.44％±3.91に減少したことが示されました。それぞれ％、および17.55％±5.11％であり、グループ間の差は統計的に有意でした（P <0.05）。フローサイトメトリー分析の結果は、OAグループの細胞アポトーシス率がCONグループの細胞アポトーシス率よりも有意に高いことを示しました（12.12％±0.72％対3.04％±0.57％、P <0.05）。低用量および高用量（8.71％±0.71％、5.71％±0.61％、p <0.05）でメトホルミン治療後に大幅に減少しました。ウエスタンブロットの結果は、CONグループと比較して、B-リンパ球リンパ腫関連タンパク質、シトクロムC、およびカスパーゼ-3の発現がOA群で増加し、B細胞リンパ腫2が減少したことを示した（P <0.05）。HepG2細胞におけるB-リンパ球リンパ腫関連タンパク質、シトクロムC、およびカスパーゼ-3タンパク質の発現は、低および高用量メトホルミンで治療した後、B細胞リンパ腫2が増加した（P <0.05）。結論：メトホルミンは、脂肪症を効果的に緩和し、非アルコール性脂肪肝疾患の細胞モデルにおけるHEPG2機能を改善することができます。メトホルミンのメカニズムは、酸化ストレス損傷の減少、ミトコンドリアアポトーシス経路に関連するタンパク質発現の調節、および細胞アポトーシスの阻害に関連している可能性があります。

Objective: To investigate the effects of metformin on mitochondrial pathway of apoptosis and oxidative stress in cell model of nonalcoholic fatty liver disease. Methods: An in vitro cell model of nonalcoholic fatty liver disease was established using 0.6 mmol/L oleic acid to induce lipid accumulation in HepG2 cells. HepG2 cells were divided into control (Con) group, oleic acid (OA) group, and metformin-low (1mmol/L) and high (10mmol/L) dose group. Oil Red O stain was used to detect intracellular lipid droplet distribution. The levels of alanine aminotransferase and aspartate aminotransferase in the culture supernatant were detected by assay kits. DCFH-DA method was used to detect the reactive oxygen species of HepG2 cells. Double staining flow cytometry was used to detect the apoptosis rate of HepG2 cells. Western blot was used to detect caspase-3, B-lymphocyte lymphoma-related protein, B-cell lymphoma 2, and cytochrome c protein. One-way analysis of variance was used to compare the data between groups. Results: Oleic acid-induced HepG2 cells were significantly increased with lipid droplets. Low and high-dose metformin had reduced intracellular lipid droplets accumulation. The effect of metformin in the high-dose group was more significant than that in the low-dose group. Aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in HepG2 cells of OA group were significantly increased, which were (43.41 ± 7.11) U/L and (29.56 ± 4.11) U/L, respectively. The intracellular aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase were decreased significantly after the treatment with low and high-dose metformin, which were (32.44 ± 4.08)U/L, (19.31 ± 3.03) U/L, (26.00 ± 3.11) U/L and (15.11 ± 4.11) U/L, respectively and the differences were statistically significant (P < 0.05). DCFH-DA test results showed that the fluorescence intensity of reactive oxygen species in the oleic acid group was 41.21% ± 4.23%, while the fluorescence intensity of reactive oxygen species in the low and high-dose metformin groups were reduced to 27.44% ± 3.91%, and 17.55% ± 5.11%, respectively and the differences between the groups were statistically significant (P < 0.05). The results of flow cytometry analysis showed that the cell apoptosis rate of the OA group was significantly higher than that of the Con group (12.12% ± 0.72% vs. 3.04% ± 0.57%, P < 0.05).The apoptosis rate of HepG2 cells was significantly reduced after metformin treatment at low and high doses (8.71% ± 0.71%, 5.71% ± 0.61%, P < 0.05). Western blot results showed that compared with the Con group, the expressions of B-lymphocyte lymphoma-related protein, cytochrome c, and caspase-3 were increased in the OA group, while the B-cell lymphoma 2 were decreased (P < 0.05). The expression of B-lymphocyte lymphoma-related protein, cytochrome c, and caspase-3 protein in HepG2 cells was decreased after treatment with low and high-dose metformin, while B-cell lymphoma 2 was increased (P < 0.05). Conclusion: Metformin can effectively alleviate steatosis and improve the HepG2 function in cell model of nonalcoholic fatty liver disease. The mechanism of metformin may be related to the reduction of oxidative stress injury, the regulation of protein expression related to mitochondrial apoptosis pathway and the inhibition of cell apoptosis.