純度を格付けし、EVマイクロリットル容積溶液の濃度を決定するための拡張カリメトリックナノプラズモニック（コナン）方法

このプロトコルペーパーでは、純度グレードを割り当て、その後、マイクロプレートカリメトリックナノプラズモニック（CONAN）アッセイによる体積のいくつかのマイクロリットルの細胞外小胞（EV）溶液を滴定する方法について説明します。コナンアッセイは、EV調製が追加される金ナノ粒子（AUNP）の溶液で構成されています。EV調製が純粋である場合、溶液は青くなりますが、外因性の単一および凝集したタンパク質（SAP、タンパク質汚染物質と呼ばれることが多い）が存在する場合は、赤いままになります。色の変化は肉眼で見られるか、UV-VIS分光法によって定量化され、純度の指標を提供します（これまでの独自の特異性）。アッセイは、検出限界<50 ng/μL（ブラッドフォードタンパク質アッセイのそれよりも数桁高い解像度）を持つ、EV関連タンパク質ではなく、SAPを標的にします。純粋な溶液の場合、アッセイは、色のシフトがAUNP/EVモル比に直線的に依存しているため、EV数を決定することもできます。代わりに、ソリューションがSAP汚染物質を負担しているかどうかを自動的に報告し、アーティファクトのカウントを避けます。コナンアッセイは堅牢で信頼性が高いことが証明されており、コスト（安価な試薬、標準のマイクロプレートリーダーが運営する安価な試薬）、作業容積（必要なサンプル1〜2μl）、および時間（完全な手順が1時間未満かかります）の面で非常に興味深いパフォーマンスを表示します。）。このアッセイは、天然および人工の脂質微小胞とナノベシクルのすべてのクラスに適用できます。

This protocol paper describes how to assign a purity grade and to subsequently titrate extracellular vesicle (EV) solutions of a few microliters in volume by microplate COlorimetric NANoplasmonic (CONAN) assay. The CONAN assay consists of a solution of gold nanoparticles (AuNPs) into which the EV preparation is added. The solution turns blue if the EV preparation is pure, whereas it stays red if soluble exogenous single and aggregated proteins (SAPs; often referred to as protein contaminants) are present. The color change is visible by the naked eye or can be quantified by UV-Vis spectroscopy, providing an index of purity (a unique peculiarity to date). The assay specifically targets SAPs, and not the EV-related proteins, with a detection limit <50 ng/μl (an order of magnitude higher resolution than that of the Bradford protein assay). For pure solutions, the assay also allows for determining the EV number, as the color shift is linearly dependent on the AuNP/EV molar ratio. Instead, it automatically reports if the solution bears SAP contaminants, thus avoiding counting artifacts. The CONAN assay proves to be robust and reliable and displays very interesting performances in terms of cost (inexpensive reagents, run by standard microplate readers), working volumes (1-2 μl of sample required), and time (full procedure takes <1 h). The assay is applicable to all classes of natural and artificial lipid microvesicles and nanovesicles.