相同性に依存しないCRISPR-CAS9精密ゲノム編集を使用したノックインヒトオルガノイドの迅速かつ効率的な生成

CRISPR-CAS9テクノロジーはゲノム編集に革命をもたらし、オルガノイドフィールドに適用できます。ただし、外因性DNA配列のヒトオルガノイドへの正確な統合には、堅牢なノックインアプローチが欠けています。ここでは、CRISPR-CAS9を介したホモロジー非依存性オルガノイドトランスジェネシス（CRISPR-HOT）について説明します。これは、異なる組織を表す効率的なノックインヒトオルガノイドを可能にします。CRISPR-HOTは、広範なクローニングを回避し、外因性DNA配列の正確な統合を目的の遺伝子座に正確に統合することにおいて、相同性（HDR）を上回ります。CRISPR-HOTを使用して、細胞内構造分子に蛍光を発揮および視覚化し、まれな腸細胞タイプのレポーター系統を生成しました。有糸分裂紡錘体が、内因性にタグ付けされたチューブリンと細胞膜によって、内因性にタグ付けされたE-カドヘリン廃止されたヒト肝細胞分裂のモードによって標識された二重レポーターイン。チューブリンのタグ付けとTP53ノックアウトを組み合わせると、TP53が肝細胞の倍数性と有糸分裂紡錘体の忠実度の制御に関与していることが明らかになりました。CRISPR-HOTは、ヒトオルガノイドのゲノム編集を簡素化します。

CRISPR-Cas9 technology has revolutionized genome editing and is applicable to the organoid field. However, precise integration of exogenous DNA sequences into human organoids is lacking robust knock-in approaches. Here, we describe CRISPR-Cas9-mediated homology-independent organoid transgenesis (CRISPR-HOT), which enables efficient generation of knock-in human organoids representing different tissues. CRISPR-HOT avoids extensive cloning and outperforms homology directed repair (HDR) in achieving precise integration of exogenous DNA sequences into desired loci, without the necessity to inactivate TP53 in untransformed cells, which was previously used to increase HDR-mediated knock-in. CRISPR-HOT was used to fluorescently tag and visualize subcellular structural molecules and to generate reporter lines for rare intestinal cell types. A double reporter-in which the mitotic spindle was labelled by endogenously tagged tubulin and the cell membrane by endogenously tagged E-cadherin-uncovered modes of human hepatocyte division. Combining tubulin tagging with TP53 knock-out revealed that TP53 is involved in controlling hepatocyte ploidy and mitotic spindle fidelity. CRISPR-HOT simplifies genome editing in human organoids.