プラスチック分解組換え酵素の構造とクローニング（Mhetase）

背景：ポリエチレンテレフタレート（PET）は、世界で最も広く生産されているポリエステルプラスチックです。PETは、エステル結合へのアクセスが制限されているため、触媒または生物学的解体化が非常に困難です。その結果、プラスチックは備蓄されるか、数百年まで予測される環境に流れ込みます。最も効果的で環境に優しいプラスチック分解法は、微生物による生分解です。PETヒドロラーゼ、PETASE、およびMHETASEの2つの特定の酵素が、Ideonella sakaiensis 201-f6から同定されています。組換え遺伝子は、分解PETにおける酵素の有効性を高めるために作られています。PETASE遺伝子の以前の研究が実施されていますが、最終的な分解PET製品を生成するには、酵素マテーゼが必要です。したがって、この研究では、Mhetase遺伝子構造が実施されました。 方法：この研究の目標は、I。sakaensis201-f6および構成プロモーターJ23106の天然シグナルペプチドを使用して、PucidtプラスミドのMhetase遺伝子を構築することです。SDS-PAGEおよび酵素の活性を使用した発現分析は、分光光度法とSEMによって分析されます。 結果：Mhetase遺伝子タンパク質は、Ideonella sakaensis 201-F6、T7ターミネーター、および構成プロモーターJ23106の天然シグナルペプチドを含むPucidt +AMPプラスミドで成功裏に構築されました。PCR分析により、遺伝子は電気泳動ゲルのバンドサイズ（1813 bp）によって細胞に成功したことが示されました。SNAP遺伝子を使用した分析、Mega Xを使用したペアワイズアラインメント、およびNCBIは、Mhetase配列がPucidtプラスミドの内フレームであることを実証されました。 結論：MheTase遺伝子は、In Silico法によってプラスミドで成功裏に構築されました。大腸菌BL21（DE3）で形質転換された合成プラスミドには、フレームにあるMhetase遺伝子配列が含まれています。したがって、大腸菌BL21（DE3）細胞は、塑性分解試験プロセスのためにMhetaseタンパク質を生成する可能性があります。大腸菌BL21（DE3）で発現したネイティブからの構成的プロモーターとシグナルペプチドを使用して、MheTase遺伝子の構成要素を特許化します。この特許とは、純粋な酵素の精製と環境条件付けを必要とせずに、全体の細胞を備えたより適用可能なプラスチック分解システムを指します。

BACKGROUND: Polyethylene terephthalate (PET) is the most widely produced polyester plastic in the world. PET is very difficult to catalyze or biological depolymerization due to the limited access to ester bonds. Consequently, plastic will be stockpiled or flowed into the environment which is projected until hundreds of years. The most effective and environmental friendly plastic degradation method is biodegradation with microorganisms. Two specific enzyme for PET hydrolase, PETase and MHETase have been identified from Ideonella sakaiensis 201-F6. Recombinant genes are made to increase the effectiveness of enzymes in degrading PET. Previous studies of the PETase gene have been carried out, but to produce the final degradation PET product, the enzyme MHETase is needed. Thus, in this study the MHETase gene construction was carried out. METHODS: The goal of this study is to construct MHETase gene in pUCIDT plasmid with native signal peptide from I. sakaensis 201-F6 and constitutive promoter J23106 was expressed in Escherichia coli BL21 (DE3) by heats shock. Expression analysis using SDS-PAGE and activity of enzyme is analyzed by spectrophotometry method and SEM. RESULTS: MHETase gene protein was successfully constructed in pUCIDT +Amp plasmid with native signal peptide from Ideonella sakaensis 201-F6, T7 terminator and constitutive promoter J23106. PCR analysis showed that the gene successfully contained in the cells by band size (1813 bp) in electrophoresis gel. Analysis using Snap Gene, pairwise alignment using MEGA X, and NCBI was demonstrated that MHETase sequence the gene was in-frame in pUCIDT plasmid. CONCLUSION: MHETase gene was successfully constructed in plasmids by in silico method. Synthetic plasmids transformed in E. coli BL21 (DE3) contain MHETase gene sequences which were in frame. Hence, the E. coli BL21 (DE3) cells have the potential to produce MHETase proteins for the plastic degradation testing process. We will patent the construct of MHETase gene using constitutive promoter and signal peptide from native which expressed in E. coli BL21 (DE3). This patent refers to a more applicable plastic degradation system with a whole cell without the need for purification and environmental conditioning of pure enzymes.