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ヒト免疫グロブリンGアイソタイプ4(IgG4)抗体は、標的細胞毒性または望ましくないサイトカイン分泌を防ぐため、拮抗薬またはアゴニスト形式での使用に適しています。しかし、治療抗体を製造している間、それらは精製中に低pHにさらされ、IgG4はIgG1よりも低PH誘導凝集の影響を受けやすい。したがって、低pHでのIgG4凝集の根本的なメカニズムを調査し、安定性を高めてIgG4を設計しました。IgG1とIgG4の定数領域を交換することにより、定数重鎖(CH3)ドメインが凝集形成に重要であると判断しましたが、IgG4のコアヒンジ安定化S228P変異は凝集を防ぐのに不十分であると判断しました。凝集しやすいアミノ酸を特定するために、IgG4のCH3ドメインをIgG1のCH3ドメインに置き換え、IgG4 Arg409をLYSに変更し、IgG1のようにIgG4バリアントの凝集を効果的に防止しました。安定化効果も、他の可変領域バリアントで記録されました。微分走査熱量測定を使用した熱安定性の分析により、R409K置換がCH3のTM値が増加したことが明らかになり、R409K変異がCH3-CH3相互作用の構造強化に寄与したことが示唆されました。R409K変異は、抗原/ヒトFCγ受容体への結合に影響を与えませんでした。一方、IgG4の同時S228PおよびR409K変異は、マウスモデルのin vitroおよびin vivoの両方で、IgG1と同じように劇的にも効果的にFab-Arm交換を抑制しました。我々の発見は、IgG4 R409Kバリアントが、安定性の向上を示す低効果活性形式で使用するための潜在的な治療IgGを表していることを示唆しています。
ヒト免疫グロブリンGアイソタイプ4(IgG4)抗体は、標的細胞毒性または望ましくないサイトカイン分泌を防ぐため、拮抗薬またはアゴニスト形式での使用に適しています。しかし、治療抗体を製造している間、それらは精製中に低pHにさらされ、IgG4はIgG1よりも低PH誘導凝集の影響を受けやすい。したがって、低pHでのIgG4凝集の根本的なメカニズムを調査し、安定性を高めてIgG4を設計しました。IgG1とIgG4の定数領域を交換することにより、定数重鎖(CH3)ドメインが凝集形成に重要であると判断しましたが、IgG4のコアヒンジ安定化S228P変異は凝集を防ぐのに不十分であると判断しました。凝集しやすいアミノ酸を特定するために、IgG4のCH3ドメインをIgG1のCH3ドメインに置き換え、IgG4 Arg409をLYSに変更し、IgG1のようにIgG4バリアントの凝集を効果的に防止しました。安定化効果も、他の可変領域バリアントで記録されました。微分走査熱量測定を使用した熱安定性の分析により、R409K置換がCH3のTM値が増加したことが明らかになり、R409K変異がCH3-CH3相互作用の構造強化に寄与したことが示唆されました。R409K変異は、抗原/ヒトFCγ受容体への結合に影響を与えませんでした。一方、IgG4の同時S228PおよびR409K変異は、マウスモデルのin vitroおよびin vivoの両方で、IgG1と同じように劇的にも効果的にFab-Arm交換を抑制しました。我々の発見は、IgG4 R409Kバリアントが、安定性の向上を示す低効果活性形式で使用するための潜在的な治療IgGを表していることを示唆しています。
Human immunoglobulin G isotype 4 (IgG4) antibodies are suitable for use in either the antagonist or agonist format because their low effector functions prevent target cytotoxicity or unwanted cytokine secretion. However, while manufacturing therapeutic antibodies, they are exposed to low pH during purification, and IgG4 is more susceptible to low-pH-induced aggregation than IgG1. Therefore, we investigated the underlying mechanisms of IgG4 aggregation at low pH and engineered an IgG4 with enhanced stability. By swapping the constant regions of IgG1 and IgG4, we determined that the constant heavy chain (CH3) domain is critical for aggregate formation, but a core-hinge-stabilizing S228P mutation in IgG4 is insufficient for preventing aggregation. To identify the aggregation-prone amino acid, we substituted the CH3 domain of IgG4 with that of IgG1, changing IgG4 Arg409 to a Lys, thereby preventing the aggregation of the IgG4 variant as effectively as in IgG1. A stabilizing effect was also recorded with other variable-region variants. Analysis of thermal stability using differential scanning calorimetry revealed that the R409K substitution increased the Tm value of CH3, suggesting that the R409K mutation contributed to the structural strengthening of the CH3-CH3 interaction. The R409K mutation did not influence the binding to antigens/human Fcγ receptors; whereas, the concurrent S228P and R409K mutations in IgG4 suppressed Fab-arm exchange drastically and as effectively as in IgG1, in both in vitro and in vivo in mice models. Our findings suggest that the IgG4 R409K variant represents a potential therapeutic IgG for use in low-effector-activity format that exhibits increased stability.
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