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この作業では、発達胎児から大人のヘモグロビンスイッチの逆転に依存するアプローチを使用して、鎌状赤血球疾患（SCD）のヒューマン症試験の開始をサポートする前臨床データを提供します。レンチウイルスをエンコードしたマイクロRNA適応ショートヘアピンRNA（Shrammir）を介したBCL11Aの赤血球特異的ノックダウンは、ガンマグロビン遺伝子の再活性化につながり、同時に病原性の成体症症β-グロビンの発現を減少させます。元の研究グレードのLVVの製造スケールアップで観察される貧弱なベクター力価を克服するために開発された洗練されたレンチウイルスベクター（LVV）BCH-BB694を生成しました。優れた製造慣行（GMP）で形質導入された健康または鎌状細胞ドナーCD34+細胞BCH-BB694 LVVは、高ベクトルコピー数（VCNS）> 5および80％の遺伝子マークを達成し、3〜5倍の誘導をもたらしました。胎児ヘモグロビン（HBF）は、in vitroまたはin vivoで遺伝子修飾細胞の成長、分化、および生着に影響を与えることなく、模擬形質導入細胞と比較しました。ベクターを介した遺伝毒性を測定するように設計されたin vitro不死化アッセイは、模擬形質導入細胞と比較して不死化の増加を示さなかった。一緒にこれらのデータは、BCH-BB694 LVVが前臨床研究では非毒性で効果的であり、SCDの治療のための臨床検査をサポートするために高力価のGMP環境で臨床的に関連するスケールで生成できることを示しています。
この作業では、発達胎児から大人のヘモグロビンスイッチの逆転に依存するアプローチを使用して、鎌状赤血球疾患（SCD）のヒューマン症試験の開始をサポートする前臨床データを提供します。レンチウイルスをエンコードしたマイクロRNA適応ショートヘアピンRNA（Shrammir）を介したBCL11Aの赤血球特異的ノックダウンは、ガンマグロビン遺伝子の再活性化につながり、同時に病原性の成体症症β-グロビンの発現を減少させます。元の研究グレードのLVVの製造スケールアップで観察される貧弱なベクター力価を克服するために開発された洗練されたレンチウイルスベクター（LVV）BCH-BB694を生成しました。優れた製造慣行（GMP）で形質導入された健康または鎌状細胞ドナーCD34+細胞BCH-BB694 LVVは、高ベクトルコピー数（VCNS）> 5および80％の遺伝子マークを達成し、3〜5倍の誘導をもたらしました。胎児ヘモグロビン（HBF）は、in vitroまたはin vivoで遺伝子修飾細胞の成長、分化、および生着に影響を与えることなく、模擬形質導入細胞と比較しました。ベクターを介した遺伝毒性を測定するように設計されたin vitro不死化アッセイは、模擬形質導入細胞と比較して不死化の増加を示さなかった。一緒にこれらのデータは、BCH-BB694 LVVが前臨床研究では非毒性で効果的であり、SCDの治療のための臨床検査をサポートするために高力価のGMP環境で臨床的に関連するスケールで生成できることを示しています。
In this work we provide preclinical data to support initiation of a first-in-human trial for sickle cell disease (SCD) using an approach that relies on reversal of the developmental fetal-to-adult hemoglobin switch. Erythroid-specific knockdown of BCL11A via a lentiviral-encoded microRNA-adapted short hairpin RNA (shRNAmiR) leads to reactivation of the gamma-globin gene while simultaneously reducing expression of the pathogenic adult sickle β-globin. We generated a refined lentiviral vector (LVV) BCH-BB694 that was developed to overcome poor vector titers observed in the manufacturing scale-up of the original research-grade LVV. Healthy or sickle cell donor CD34+ cells transduced with Good Manufacturing Practices (GMP)-grade BCH-BB694 LVV achieved high vector copy numbers (VCNs) >5 and gene marking of >80%, resulting in a 3- to 5-fold induction of fetal hemoglobin (HbF) compared with mock-transduced cells without affecting growth, differentiation, and engraftment of gene-modified cells in vitro or in vivo. In vitro immortalization assays, which are designed to measure vector-mediated genotoxicity, showed no increased immortalization compared with mock-transduced cells. Together these data demonstrate that BCH-BB694 LVV is non-toxic and efficacious in preclinical studies, and can be generated at a clinically relevant scale in a GMP setting at high titer to support clinical testing for the treatment of SCD.
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