最適化されたHITS-CLIPメソッドを使用した核細胞質シャトリングRNA結合タンパク質HNRNPUの分析

RNA結合タンパク質（RBPS）は、mRNAスプライシング、mRNA安定性、翻訳効率を含む多くのタイプの転写後調節を標的RNAに直接結合することにより制御し、それらの突然変異と機能障害は、いくつかのヒト神経疾患および腫瘍形成に関連していることがよくあります。ハイスループットシーケンス（HITS-CLIP）と組み合わせた架橋免疫沈降（CLIP）は、トランスクリプトームレベルでのRBP標的シーケンスの包括的な同定により、疾患の病因の根底にある分子メカニズムを調査するための強力な手法です。ただし、実験的な合併症、効率が低く、時間がかかるため、いくつかの最適化にはヒットクリッププロトコルが必要であり、そのライブラリを非常に少量のRNAから生成する必要があります。ここでは、Brdu-Clipを最適化することにより、より効率的で迅速で再現可能なクリップ方法を改善しました。私たちのプロトコルは、事前に増幅されたクリップライブラリの10倍の収率を生み出し、ライブラリの増幅に必要なPCRサイクルの数が減少したため、クリップタグ読み取りの重複速度が少なくなりました。収量の分散も減少し、実験期間は2日間短縮されました。これを使用して、核RBP、hnrnpuによってIL-6発現を検証しました。これは、HELA細胞のIL-6 mRNAの3'-UTRを直接結合しました。重要なことに、この相互作用は細胞質画分でのみ観察され、mRNA安定性制御における細胞質HnRNPUの役割を示唆しています。この最適化された方法により、標的遺伝子を正確に識別することができ、核細胞質シャトリングRBPのタンパク質-RNA相互作用のスナップショットを提供します。

RNA-binding proteins (RBPs) control many types of post-transcriptional regulation, including mRNA splicing, mRNA stability, and translational efficiency, by directly binding to their target RNAs and their mutation and dysfunction are often associated with several human neurological diseases and tumorigenesis. Crosslinking immunoprecipitation (CLIP), coupled with high-throughput sequencing (HITS-CLIP), is a powerful technique for investigating the molecular mechanisms underlying disease pathogenesis by comprehensive identification of RBP target sequences at the transcriptome level. However, HITS-CLIP protocol is still required for some optimization due to experimental complication, low efficiency and time-consuming, whose library has to be generated from very small amounts of RNAs. Here we improved a more efficient, rapid, and reproducible CLIP method by optimizing BrdU-CLIP. Our protocol produced a 10-fold greater yield of pre-amplified CLIP library, which resulted in a low duplicate rate of CLIP-tag reads because the number of PCR cycles required for library amplification was reduced. Variance of the yields was also reduced, and the experimental period was shortened by 2 days. Using this, we validated IL-6 expression by a nuclear RBP, HNRNPU, which directly binds the 3'-UTR of IL-6 mRNA in HeLa cells. Importantly, this interaction was only observed in the cytoplasmic fraction, suggesting a role of cytoplasmic HNRNPU in mRNA stability control. This optimized method enables us to accurately identify target genes and provides a snapshot of the protein-RNA interactions of nucleocytoplasmic shuttling RBPs.