クローン化された染色体NIF-DNAマーカーを含む幅広い宿主範囲プラスミドによるAzotobacter Vinelandii OPの変換

Azotobacter Vinelandii OP（UW）の非ニトロゲン固定（NIF-）株UW10は、A。VinelandiiUW（NIF+）からのクローン化された野生型NIF-10遺伝子座を含む幅広い宿主範囲プラスミドPKT210で自然に誘導され、変換されました。;このマーカーは、トランスのNIF-10変異を補完することができませんでしたが、染色体との組換えによって可能になりました。観察された最も頻繁なタイプの形質転換イベントは、プラスミドの相同領域とプラスミドベクターの喪失を伴う染色体（NIF+形質転換体を産生）間の組換えでした。大幅に低い周波数では、プラスミドエンコード抗生物質耐性決定因子を発現する形質転換体が分離され、表現型ではnif-がありました。アガロースゲル電気泳動は、これらの形質転換体には、元のドナープラスミドと同じ移動性で移動するプラスミドが含まれていることを示しました。培養中、これらの形質転換体は、クローン化されたNIF-DNAフラグメントに特異的なハイブリダイゼーションプローブの使用によって判断されるように、プラスミドの喪失なしにNIF+表現型を獲得しました。これらのデータは、染色体と相同の配列を運ぶプラスミドが、組換え充実したA. vinelandii UWで維持できることを示しています。染色体配列と相同な配列を含むプラスミドの導入は、凝集末端を生成する制限エンドヌクレアーゼを使用したプラスミドのプレリネア化によって促進されました。線形化の部位は、共有相同性の領域の外で選択できるため、プラスミドの確立の経路が相同性化された形質転換メカニズムを介して発生する可能性は低かった。データはまた、A。vinelandiiUWが、その窒素固定能力の有意な障害なしにプラスミドRSF1010に基づいて、幅広いホスト範囲クローニングベクターを抱くことができることを示しています。

The non-nitrogen-fixing (Nif-) strain UW10 of Azotobacter vinelandii OP (UW) was naturally induced to competence and transformed with broad host range plasmid pKT210 containing the cloned wild-type nif-10 locus from A. vinelandii UW (Nif+); this marker was unable to complement the nif-10 mutation in trans, but could through recombination with the chromosome. The most frequent type of transformation event observed was recombination between the homologous regions of the plasmid and chromosome (producing Nif+ transformants) with loss of the plasmid vector. At a substantially lower frequency, transformants expressing the plasmid-encoded antibiotic resistance determinants were isolated which were phenotypically Nif-. Agarose gel electrophoresis showed that these transformants contained a plasmid migrating with the same mobility as the original donor plasmid. During culture these transformants acquired a Nif+ phenotype without the loss of the plasmid, as judged by the use of a hybridization probe specific for the cloned nif-DNA fragment. These data indicate that plasmids carrying sequences homologous to chromosomal sequences could be maintained in recombination-proficient A. vinelandii UW. The introduction of plasmids containing sequences homologous to chromosomal sequences was facilitated by prelinearization of the plasmid using a restriction endonuclease generating cohesive ends. Because the site of linearization could be chosen outside the region of shared homology, it was unlikely that the route of plasmid establishment occurred via a homology-facilitated transformation mechanism. The data also indicated that A. vinelandii UW could harbor broad host range cloning vectors based on plasmid RSF1010 without significant impairment of its nitrogen-fixation ability.