タンパク質プロビシティビオチン化のためのバイオイドとターボイドの比較応用

バイオイドは、タンパク質間相互作用を特定するための確立された方法であり、生きている細胞およびいくつかの動物モデル内で利用されています。ただし、従来の標識期間には、一部の用途には理想的ではない堅牢なビオチン化には15〜18時間必要です。最近、ターボイドとミニトゥルボと呼ばれる2つの新しいリガーゼが、バイオイドリガーゼの直接的な進化を使用して開発され、過剰なビオチンとの10分間のインキュベーション後に堅牢なビオチン化を生成することができました。ただし、ビオチン化、細胞毒性、およびリガーゼの安定性の誘導性に関する懸念が報告されています。ターボイドの実用的な応用をさらに調査し、バイオイドと比較して長所と短所を確認するために、バイオイドおよびターボイド融合タンパク質を発現するいくつかの安定した細胞株を開発し、免疫ブロット、免疫蛍光、およびビオチン親和性精製ベースのプロテオミックを介してそれらを分析しました。ターボイドの場合、タンパク質の不安定性、外因性ビオチンの非存在下での持続的なビオチン化、および実用的な標識半径の増加が観察されました。しかし、ターボイドは、バイオイドと比較して小胞体腔内腔内で堅牢なビオチン化を可能にしました。ドキシサイクリン誘導性の発現とビオチン枯渇培地の成長を組み合わせることにより、ビオチン化の誘導を達成できます。これらの研究は、特定のニーズに合った適切なリガーゼと実験プロトコルに関してバイオイドベースの方法を利用して研究者に通知するのに役立つはずです。

BioID is a well-established method for identifying protein-protein interactions and has been utilized within live cells and several animal models. However, the conventional labeling period requires 15-18 h for robust biotinylation which may not be ideal for some applications. Recently, two new ligases termed TurboID and miniTurbo were developed using directed evolution of the BioID ligase and were able to produce robust biotinylation following a 10 min incubation with excess biotin. However, there is reported concern about inducibility of biotinylation, cellular toxicity, and ligase stability. To further investigate the practical applications of TurboID and ascertain strengths and weaknesses compared to BioID, we developed several stable cell lines expressing BioID and TurboID fusion proteins and analyzed them via immunoblot, immunofluorescence, and biotin-affinity purification-based proteomics. For TurboID we observed signs of protein instability, persistent biotinylation in the absence of exogenous biotin, and an increase in the practical labeling radius. However, TurboID enabled robust biotinylation in the endoplasmic reticulum lumen compared to BioID. Induction of biotinylation could be achieved by combining doxycycline-inducible expression with growth in biotin depleted culture media. These studies should help inform investigators utilizing BioID-based methods as to the appropriate ligase and experimental protocol for their particular needs.