焦点接着キナーゼとSRCは、フィブリノーゲンγC-末端断片によって引き起こされる微小血管過摂取性を媒介します

目的：Fibrinogen-γ鎖C末端産物（γC）に起因する微小血管漏出がRHOA依存性メカニズムを介して発生したことを以前に報告しました。この研究の目的は、γcが内皮性過輸血を誘導するシグナル伝達メカニズムをさらに解明することでした。γCは、チロシンキナーゼFAKおよびSRCによって媒介される細胞内シグナル伝達に関与する膜貫通インテグリン受容体である内皮αvβ3に結合して活性化することが知られているため、γCが溶解した溶解性経路を活性化することにより内皮障壁機能を変化させると仮定しました。 方法と結果：ラット腸間膜微小血管の生息地顕微鏡を使用して、γc投与に起因する血漿タンパク質（アルブミン）の拡血の増加を示します。さらに、毛細血管液ろ過係数（KFC）は、γC誘発肺血管透過性の上昇を示しました。さらに、γCは、培養ラット肺微小血管内皮細胞（RLMVECS）における時間依存性および用量関連の方法での内皮経皮バリア抵抗性を低下させ、西部ブロットによるFAK/SRCリン酸化検出の増加を伴いました。FAKの薬理学的阻害または遺伝子サイレンシングによる実験では、微小血管間のγC誘発アルブミンと液体漏れが有意に減少し、ストレス繊維形成、VE-カドヘリンチロシンリン酸化、およびγC誘発性内皮障壁機能不全の改善が示され、FAKがγC療法に関与することを示します。SRCが同様の方法で標的にされたときに同等の結果が見つかりましたが、FAKの阻害によりSRCの活性化が妨げられ、FAKがγCを介した高経験性におけるSRCの上流であることが示唆されました。さらに、γC誘発性細胞骨格ストレス繊維形成は、RhoA阻害と同時に、これらのチロシンキナーゼの阻害またはサイレンシング中に減衰しました。 結論：FAK-SRC経路は、RhoAおよびストレス繊維形成を含む方法でのγC誘発性微小血管バリア機能障害、接合タンパク質のリン酸化、および混乱に寄与します。

OBJECTIVES: We previously reported microvascular leakage resulting from fibrinogen-γ chain C-terminal products (γC) occurred via a RhoA-dependent mechanism. The objective of this study was to further elucidate the signaling mechanism by which γC induces endothelial hyperpermeability. Since it is known that γC binds and activates endothelial αvβ3, a transmembrane integrin receptor involved in intracellular signaling mediated by the tyrosine kinases FAK and Src, we hypothesized that γC alters endothelial barrier function by activating the FAK-Src pathway leading to junction dissociation and RhoA driven cytoskeletal stress-fiber formation. METHODS AND RESULTS: Using intravital microscopy of rat mesenteric microvessels, we show increased extravasation of plasma protein (albumin) resulting from γC administration. In addition, capillary fluid filtration coefficient (Kfc) indicated γC-induced elevated lung vascular permeability. Furthermore, γC decreased transendothelial barrier resistance in a time-dependent and dose-related fashion in cultured rat lung microvascular endothelial cells (RLMVECs), accompanied by increased FAK/Src phosphorylation detection by western blot. Experiments with pharmacological inhibition or gene silencing of FAK showed significantly reduced γC-induced albumin and fluid leakage across microvessels, stress-fiber formation, VE-cadherin tyrosine phosphorylation, and improved γC-induced endothelial barrier dysfunction, indicating the involvement of FAK in γC mediated hyperpermeability. Comparable results were found when Src was targeted in a similar manner, however inhibition of FAK prevented Src activation, suggesting that FAK is upstream of Src in γC-mediated hyperpermeability. In addition, γC-induced cytoskeletal stress-fiber formation was attenuated during inhibition or silencing of these tyrosine kinases, concomitantly with RhoA inhibition. CONCLUSION: The FAK-Src pathway contributes to γC-induced microvascular barrier dysfunction, junction protein phosphorylation and disorganization in a manner that involves RhoA and stress-fiber formation.