イオンペアリングの開発LC-MS/MSメソッドのイタコネートおよびCIS-細胞抽出物および細胞媒体のCIS-同化法

リポ多糖（LPS）およびインターフェロンガンマ（IFN-γ）によって誘導されるマクロファージにおける免疫応答性遺伝子1（IRG1）の蓄積は、シス酸化剤の脱炭酸によるイタコネートの産生をもたらします。IRG1およびイタコネートに関連する生物学は完全には理解されていません。イタコネートを測定するための迅速で敏感な方法は、IRG1生物学の研究に利益をもたらします。複数のHPLCおよび誘導体化方法がテストされました。イオンペアリング剤としてトリビタミン/ギ酸を使用したイオンペアリングLC-MS/MSメソッドおよび私たちが提案したハイパーCARBTMガードカラムでは、イタコネートにより優れたピーク形状とより良い感度が示されました。現在のプロトコルは、ドライダウンステップを避けるために、80％メタノール/水溶液中の誘導体化と直接分析なしで、イタコネート、シトラコネート、およびシスのベースライン分離を可能にします。4.5分間の実行時間で、カラム上の30 pgイタコン酸の定量（LOQ）の限界を提供します。この方法は、96ウェルプレート形式のRAW264.7細胞抽出物および細胞媒体でのイタコネートおよびシスの測定のために検証されています。この方法を適用して、LPS/IFN-γ治療後の生細胞抽出物と細胞培地のイタコネートの増加とCISアコンテートの減少をうまく測定しました。

Accumulation of Immune Responsive Gene 1(IRG1) in macrophage induced by lipopolysaccharide (LPS) and interferon gamma (IFN-γ) leads to production of itaconate by decarboxylation of cis-aconitate. The biology associated with IRG1 and itaconate is not fully understood. A rapid and sensitive method for measurement of itaconate will benefit the study of IRG1 biology. Multiple HPLC and derivatization methods were tested. An ion pairing LC-MS/MS method using tributylamine/formic acid as ion pairing agents and a HypercarbTM guard column we proposed demonstrated better peak shape and better sensitivity for itaconate. The current protocol allows baseline separation of itaconate, citraconate, and cis-aconitate without derivatization and direct analysis of analytes in 80% methanol/water solution to avoid the dry-down step. It provides the limit of quantitation (LOQ) of 30 pg itaconate on column with a 4.5-minute run time. This method is validated for measurement of itaconate and cis-aconitate in RAW264.7 cell extract and cell media in a 96-well plate format. We applied this method to successfully measure the increase of itaconate and the decrease of cis-aconitate in RAW cell extract and cell media after LPS/IFN-γ treatment.