GoldenBac：バキュロウイルス発現ベクターシステムで使用するための多遺伝子発現ベクターを構築するためのシンプルで非常に効率的で広く適用可能なシステム

背景：真核生物における大型タンパク質複合体の組換えタンパク質産生と精製には、個々の遺伝子が独自のプロモーターとターミネーターの制御下にある多遺伝子発現構築物を生成するために効率的な方法が必要です。現在の方法は、CRE-Loxテクノロジーを介したLOXPサイトを含むいくつかのベクトルの組み合わせのシリアルラウンド、またはPCRまたはその他の方法を介した複数の遺伝子組み合わせのいずれかに基づいています。これらの方法はマルチステップであり、単一の遺伝子クローンよりも効率が低く、関心のあるすべての遺伝子が最終積に存在することを確認するために面倒なプロセスが必要になる場合があります。ここでは、TN7転置またはKO1629ベースの相同組換えを使用して、バキュロウイルス発現ベクターシステム（BEV）と互換性のあるマルチジェーン発現構築物の生成のための迅速でシンプルなゴールデンゲートベースのシステムについて説明します。。 結果：この方法は、BSAI型IIS制限酵素の切断部位に隣接する関心ターミネーターカセットのプロモーター遺伝子を含む一連のベクターの構築に基づいています。この一連のベクトルは、独自のオーバーハングでカセットを除去するためにBSAIによってカットできます。同じ反応では、カセットは最終的な宛先ベクトルの正しい配列で結合され、2〜15の遺伝子を含む多遺伝子発現構築物を生成します。したがって、個々の発現構造は、最大14の発現カセットを組み合わせると90％以上の効率で、単一の反応で単一のベクトルに結合できます。3つの異なる共発現システムの成功した構造と発現、プロテオソーム蓋複合体、複合体/シクソームを促進する段階（APC/C）、およびシャペロンの共発現の効果の溶解度に対する効果のテストに使用される一連の構成要素を示します。HOIPタンパク質。 結論：この堅牢なシングルステップクローニングシステムは、転置と相同組換えベースのバキュロウイルスシステムの両方に対して多遺伝子発現構造の生成に使いやすい方法を提供し、この技術をバキュロウイルス発現システムを使用してすべての研究所で利用できるようにします。この非常に効率的でシンプルな方法により、タンパク質生産施設の標準化されたサービスポートフォリオにクローニングされている多遺伝子発現の迅速な組み込みが可能になり、マルチジェーンバキュロウイルス構造の日常的な生成のために、あらゆる研究室でも簡単に採用できます。

BACKGROUND: Recombinant protein production and purification of large protein complexes in eukaryotes requires efficient methods to generate multi-gene expression constructs, where each individual gene is under the control of its own promoter and terminator. Current methods are based either on serial rounds of combination of several vectors containing loxP sites via the Cre-lox technology, or on multiple rounds of gene combination via PCR or other methods. These methods are multi-step, have lower efficiencies than single gene cloning, and may require laborious processes to verify that all genes of interest are present in the final product. Here, we describe a rapid and simple Golden Gate-based system for the generation of multi-gene expression constructs compatible with baculovirus expression vector systems (BEVS) using either Tn7 transposition or KO1629-based homologous recombination, which we refer to as "GoldenBac". RESULTS: This method is based on the construction of a series of vectors containing a promoter-gene of interest-terminator cassette flanked by cleavage sites of the BsaI type IIS restriction enzyme. This series of vectors can be cut by BsaI to excise cassettes with unique overhangs. In the same reaction, the cassettes are then ligated in the correct sequence in a final destination vector to generate multi-gene expression constructs containing 2-15 genes. Individual expression constructs can therefore be combined into a single vector in a single reaction, with over 90% efficiency when combining up to 14 expression cassettes. We demonstrate successful construction and expression of three different co-expression systems, the proteosomal lid complex, the anaphase promoting complex/cyclosome (APC/C), and a series of constructs used to test the effect of chaperone co-expression on the solubility of the HOIP protein. CONCLUSIONS: This robust, single-step cloning system provides an easy-to-use method for generation of multi-gene expression constructs for both transposition and homologous recombination-based baculovirus systems, making this technology available across all laboratories using baculovirus expression systems. This highly efficient and simple method allows for rapid incorporation of multi-gene expression cloning into the standardized service portfolio of protein production facilities and can also easily be adopted by any laboratory for routine generation of multi-gene baculovirus constructs.