Schizosaccharomyces Pombeの遺伝子工学：URA4遺伝子を選択可能なマーカーとして使用した遺伝子破壊と置換のシステム

オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼの構造遺伝子である相同選択マーカーであるURA4に基づいて、Schizosaccharomyces Pombeの遺伝子破壊と置換について説明されています。野生型遺伝子の単一のコピーの存在は、URA4補助栄養変異体を救うことができます。さらに、Ura4-細胞は、5-フルオロ剤酸（5-FOA）の存在下で選択できます。これにより、前方と後方の両方の変異を選択する便利な手段が可能になります。機能性遺伝子を含む1.8 kbヒンディーイフラグメントの配列が報告されています。他の生物からのオロチジン-5'-リン酸（OMP）デカルボキシラーゼとかなりの保存を示す264アミノ酸の単一のオープンリーディングフレームをコードします。URA4転写産物の長さは約850ヌクレオチドです。タンパク質コーディングシーケンスの上流51 bpで始まり、転写終了が翻訳停止コドンでまたは非常に近いという点では珍しいことです。遺伝子破壊実験でのURA4の使用を容易にするために、1.8 kb Hindiiiフラグメントが染色体から削除されているURA4-D18と呼ばれるS. Pombeの新規株も構築しました。URA4を選択可能なマーカーとして含むこのひずみとベクターの組み合わせを使用して、調査中の染色体遺伝子座への組換えイベントを標的とする一般的な方法を提示します。

A system is described for gene disruption and replacement in Schizosaccharomyces pombe based on the homologous selectable marker, ura4, the structural gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase. The presence of a single copy of the wild-type gene can rescue a ura4 auxotrophic mutant. Furthermore, ura4- cells can be selected for in the presence of 5-fluoroorotic acid (5-FOA). This allows a convenient means of selecting for both forward and backward mutations. The sequence of a 1.8 kb HindIII fragment which contains the functional gene is reported. It encodes a single open reading frame of 264 amino acids which shows considerable conservation with the orotidine-5'-phosphate (OMP) decarboxylases from other organisms. The ura4 transcript is approximately 850 nucleotides long. It begins 51 bp upstream of the protein coding sequence and is unusual in that transcription termination occurs at or very close to the translational stop codon. To facilitate the use of ura4 in gene disruption experiments we have also constructed a novel strain of S. pombe called ura4-D18, in which the 1.8 kb HindIII fragment has been deleted from the chromosome. Using a combination of this strain and vectors containing ura4 as a selectable marker, we present a general method for targeting recombination events to the chromosomal locus under investigation.