変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節、滑膜組織内の免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー分析

変形性関節症（OA）は、最も一般的な筋骨格疾患の1つであり、痛みや身体的制限に苦しむ患者に影響を与えます。最近の証拠は、T細胞と単球/マクロファージの両方がOAの病因に関連する可能性のある疾患の潜在的な炎症成分を示しています。さらなる研究では、Th1、Th2、Th17、T調節リンパ球などの炎症性細胞系統のサブセット、およびM1、M2、および滑膜組織居住マクロファージなどの両方の炎症性細胞系統の重要な役割を仮定しました。ただし、局所滑膜と全身性炎症性細胞応答と関節の構造変化との相互作用は不明です。T細胞と単球/マクロファージがOAにどのように寄与するかを完全に理解するには、これらの細胞とそのサブセットを同時に滑膜組織、二次リンパ器官、および全身的に（脾臓および骨髄）に同時に識別できることが重要です。今日、さまざまな炎症性細胞サブセットは、細胞表面マーカーの組み合わせによって、多色のフローサイトメトリーをこれらの細胞プロセスを調査する際の強力な手法とすることで識別できます。このプロトコルでは、滑膜組織と二次リンパ器官の採取、および単一細胞懸濁液の生成に関する詳細な手順について説明します。さらに、単球/マクロファージとそのサブセットを特定するための細胞外染色アッセイの両方を提示し、マウス脾臓、骨髄、リンパ節、および滑膜組織内のT細胞とそのサブセットを同定する細胞内および細胞内染色アッセイの両方を提示します。。このプロトコルの各ステップは最適化およびテストされたため、他の外科的および非外科的OAマウスモデルに使用できる非常に再現性のあるアッセイが得られました。

Osteoarthritis (OA) is one of the most prevalent musculoskeletal diseases, affecting patients suffering from pain and physical limitations. Recent evidence indicates a potential inflammatory component of the disease, with both T-cells and monocytes/macrophages potentially associated with the pathogenesis of OA. Further studies postulated an important role for subsets of both inflammatory cell lineages, such as Th1, Th2, Th17, and T-regulatory lymphocytes, and M1, M2, and synovium-tissue-resident macrophages. However, the interaction between the local synovial and systemic inflammatory cellular response and the structural changes in the joint is unknown. To fully understand how T-cells and monocytes/macrophages contribute towards OA, it is important to be able to quantitively identify these cells and their subsets simultaneously in synovial tissue, secondary lymphatic organs and systemically (the spleen and bone marrow). Nowadays, the different inflammatory cell subsets can be identified by a combination of cell-surface markers making multi-color flow cytometry a powerful technique in investigating these cellular processes. In this protocol, we describe detailed steps regarding the harvest of synovial tissue and secondary lymphatic organs as well as generation of single cell suspensions. Furthermore, we present both an extracellular staining assay to identify monocytes/macrophages and their subsets as well as an extra- and intra-cellular staining assay to identify T-cells and their subsets within the murine spleen, bone marrow, lymph nodes and synovial tissue. Each step of this protocol was optimized and tested, resulting in a highly reproducible assay that can be utilized for other surgical and non-surgical OA mouse models.