大腸菌におけるメガベースサイズのプラスミド構造の課題を克服する

大腸菌はプラスミド構造に人気のあるツールでしたが、この細菌は500キロ塩基を超える大きなプラスミドを構築するのに「不適切」であると考えられていました。従来のプラスミドベクターは、安定した複製とそのような大きなプラスミドの分離に必要ないくつかの調節DNA要素を欠いている可能性があると想定しました。さらに、いくつかのサイト固有の組換えシステムを使用すると、大規模なDNAセグメントのクローニングが促進される場合があります。ここでは、新しい細菌の人工染色体（BAC）ベクターを使用して、1メガベース（1-MB）二次染色体を構築するための2つの戦略を示します。まず、ゲノム還元大腸菌株の3-MBゲノムを2つの染色体（2-MBと1-MB）に分割しました。染色体。この染色体核分裂法（FLP-POPクローニング）は、フリッパーゼ媒介切除を介して機能します。これは、クロラムフェニコールの選択を可能にする分割クロラムフェニコール耐性遺伝子の再組み立てと一致します。次に、1 MBプラスミドを開発するための新しいクローニング方法（ORIT-POPクローニング）と設備の装備のBACベクター（PMEGABAC1H）を開発しました。2つの0.5-MBゲノム領域を連続的に2つのドナー株からレシピエント株に結合を介してレシピエント株に移し、レシピエント株でPMEGABAC1Hによって捕捉されて1 MBプラスミドを産生しました。この1-MBプラスミドは、結合を介して別の大腸菌株に伝染性がありました。さらに、これらの1-MB二次染色体は、再構成された大腸菌染色体複製サイクル反応（RCR）を使用することにより、in vitroで増幅可能でした。これらの戦略と技術は、人気のある大腸菌細胞を、デザイナー染色体工学の生産的な工場とするでしょう。

Although Escherichia coli has been a popular tool for plasmid construction, this bacterium was believed to be "unsuitable" for constructing a large plasmid whose size exceeds 500 kilobases. We assumed that traditional plasmid vectors may lack some regulatory DNA elements required for the stable replication and segregation of such a large plasmid. In addition, the use of a few site-specific recombination systems may facilitate cloning of large DNA segments. Here we show two strategies for constructing 1-megabase (1-Mb) secondary chromosomes by using new bacterial artificial chromosome (BAC) vectors. First, the 3-Mb genome of a genome-reduced E. coli strain was split into two chromosomes (2-Mb and 1-Mb), of which the smaller one has the origin of replication and the partitioning locus of the Vibrio tubiashii secondary chromosome. This chromosome fission method (Flp-POP cloning) works via flippase-mediated excision, which coincides with the reassembly of a split chloramphenicol resistance gene, allowing chloramphenicol selection. Next, we developed a new cloning method (oriT-POP cloning) and a fully equipped BAC vector (pMegaBAC1H) for developing a 1-Mb plasmid. Two 0.5-Mb genomic regions were sequentially transferred from two donor strains to a recipient strain via conjugation and captured by pMegaBAC1H in the recipient strain to produce a 1-Mb plasmid. This 1-Mb plasmid was transmissible to another E. coli strain via conjugation. Furthermore, these 1-Mb secondary chromosomes were amplifiable in vitro by using the reconstituted E. coli chromosome replication cycle reaction (RCR). These strategies and technologies would make popular E. coli cells a productive factory for designer chromosome engineering.