有毒および薬用植物ダトゥライノキシアミルにおけるヒオスミン6β-ヒドロキシラーゼ（H6H）の分子クローニングと機能分析

伝統的な中国の漢方薬であるDatura Innoxia Mill。は、ヒオスミンやスコポラミンなどのトロパンアルカロイドを生成します。スコポラミンは、その薬理学的効果が強く、副反応が少ないため、ヒオスミアミンよりも大きな需要があります。太陽植物から抽出されています。ただし、スコポラミンの含有量は、D。ninoxiaのヒオスシアミンよりも低いです。ヒオスシアミン6β-ヒドロキシラーゼ（H6H、EC1.14.11.11）は、ヒオスシアミンを触媒してスコポラミンを形成できる重要な酵素です。この研究では、H6HをコードするcDNAをD. Innoxia Rootsからクローニングし、DiH6Hと名付けました。全長cDNAの長さは1413 bpで、347アミノ酸をコードする1044 bpのオープンリーディングフレームがあります。D. Innoxia H6H（DiH6H）の推定されたタンパク質配列は、他の植物からのH6HSと高い同一性を共有しました。DiH6Hは、大腸菌で異種発現し、His-TAGアフィニティ技術を介して精製されました。組換えDiH6Hは、ヒオスシアミンをスコポラミンに形質転換する活性を示しました。DiH6H mRNAはさまざまな組織で検出されましたが、根のそのレベルは他の組織のレベルよりも高かった。実際、スコポラミンの蓄積は根が低かったが、航空部品、特に花や種子では非常に高かった。これらの観察結果は、スコポラミンが根で合成され、その後空中部に輸送される可能性があることを示唆しています。Dih6Hのin vivo機能をさらに検証するために、Dih6HのcDNAはD. innoxiaの毛状の根で過剰発現しました。予想どおり、陽性形質転換体でスコポラミン産生の増加が観察されました。この結果は、D。ninoxiaの生合成経路の代謝工学により、スコポラミン収率を増加させるための潜在的な戦略を提供します。

Datura innoxia Mill., a traditional Chinese herbal medicine, produces tropane alkaloids such as hyoscyamine and scopolamine. Scopolamine has a larger demand than hyoscyamine due to its stronger pharmacological effects and fewer side reactions. It is extracted from solanaceous plants. However, the content of scopolamine is lower than hyoscyamine in D. innoxia. Hyoscyamine 6β-hydroxylase (H6H, EC1.14.11.11) is the key enzyme which can catalyze hyoscyamine to form scopolamine. In this study, a cDNA encoding H6H was cloned from D. innoxia roots and named Dih6h. The full-length cDNA is 1413 bp in length with a 1044-bp open reading frame encoding 347 amino acids. The deduced protein sequence of D. innoxia H6H (DiH6H) shared high identity with H6Hs from other plants. The DiH6H was heterologously expressed in Escherichia coli and purified via His-tag affinity technique. The recombinant DiH6H showed activity in transforming hyoscyamine to scopolamine. Despite Dih6h mRNA was detected in various tissues, its levels in roots were higher than that in other tissues. Indeed, scopolamine accumulation was low in roots, but it was very high in aerial parts, especially in flowers and seeds. These observations suggest that scopolamine may be synthesized in the roots and subsequently transported to the aerial parts. To further verify in vivo function of DiH6H, the cDNA of DiH6H was overexpressed in D. innoxia hairy roots. As expected, an increase of scopolamine production was observed in the positive transformants. The results provide a potential strategy for increasing scopolamine yield by metabolic engineering of its biosynthetic pathway in D. innoxia.