機能性キャップ結合真核生物の開始因子EIF-4E-4E-4E-4E-4Eとアフィニティ精製の大腸菌における高レベルの合成と、単純化されたキャップアナログ樹脂を使用

多数の研究が、タンパク質生合成中に真核生物開始因子-4E（eIF-4E）が果たす重要な役割を確立しています。しかし、主に細胞の存在量が少ないため、eIF-4Eの生化学的特性評価は困難であることが判明しました。EIF-4Eに関する研究を促進するために、大腸菌でSaccharomyces cerevisiae eif-4eを過剰発現しました。EIF-4Eの分離は、以前に報告されたものよりもかなり要求が少ないキャップアナログアフィニティマトリックス（アガロース樹脂）を使用して簡素化されました。1 mLの大腸菌培養から2〜5マイクログラムの均質で積極的なeIF-4Eの調製を得ることができるシンプルで迅速な精製スキームについて説明します。大腸菌発現EIF-4Eは、キャップ構造を結合する能力によって決定されるようにアクティブです。結果は、EIF-4Eのキャップ結合活性が、真核細胞から分離されたeIF-4E調製物に低レベルで存在する他のタンパク質の存在に依存していないことを示しています。

Numerous studies have established the important role that eukaryotic initiation factor-4E (eIF-4E) plays during protein biosynthesis. However, biochemical characterization of eIF-4E has proved difficult, mainly because of its low abundance in cells. To facilitate studies on eIF-4E, we have overexpressed Saccharomyces cerevisiae eIF-4E in Escherichia coli. The isolation of eIF-4E was simplified by using a cap-analog affinity matrix (agarose resin) that is considerably less demanding to prepare than those previously reported. We describe a simple and rapid purification scheme that can yield 2-5 micrograms of a homogenous and active preparation of eIF-4E from 1 ml of E. coli culture. E. coli-expressed eIF-4E is active as determined by its ability to bind the cap structure. The results demonstrate that the cap-binding activity of eIF-4E is not dependent on the presence of other proteins that are present at low levels in eIF-4E preparations isolated from eukaryotic cells.