細胞RNAのA-t-I編集部位の検出を改善するためのEndoviper-seq

アデノシンからイノシンへの（A-to-I）RNA編集は、さまざまな細胞プロセスにとって重要な転写後の保存された修飾です。A-to-I編集は、ほぼすべてのタイプのRNAで広く普及しており、細胞機能と挙動に大きなグローバルな変化を直接伝えます。機能不全のRNA編集も多くの疾患に関係しており、A-to-I編集活動は、癌、免疫障害、および神経変性の早期発見のために急速に重要なバイオマーカーになりつつあります。何百万ものサイトが特定されていますが、これらのサイトの大部分の生物学的機能は不明であり、個々のサイトでの編集活動を制御するための規制メカニズムはよく理解されていません。トランスクリプトーム全体のA-to-I編集アクティビティの堅牢な検出とマッピングは、これらの特性と編集が細胞の挙動にどのように影響するかを理解するために不可欠です。ただし、RNA-seqに存在する固有のサンプリングエラーのため、A-to-I編集サイトを正確に識別することは困難です。最近、エンドヌクレアーゼv免疫沈降濃縮シーケンス（Endoviper-seq）を開発して、シーケンス前にA-t-I編集されたRNAを濃縮することにより、この課題に直接対処しました。このプロトコルは、セルラーRNAを処理し、A-to-I編集されたトランスクリプトをEndoviper Pulldownで濃縮する方法を概説し、RNA-seqデータの生成に適したライブラリを準備します。©2020 Wiley Periodicals LLC。基本プロトコル1：mRNAの断片化とグリオキサール化基本プロトコル2：エンドヴァイパープルダウン基本プロトコル3：RNA-seqライブラリの準備とデータ分析。

Adenosine to-inosine (A-to-I) RNA editing is a conserved post-transcriptional modification that is critical for a variety of cellular processes. A-to-I editing is widespread in nearly all types of RNA, directly imparting significant global changes in cellular function and behavior. Dysfunctional RNA editing is also implicated in a number of diseases, and A-to-I editing activity is rapidly becoming an important biomarker for early detection of cancer, immune disorders, and neurodegeneration. While millions of sites have been identified, the biological function of the majority of these sites is unknown, and the regulatory mechanisms for controlling editing activity at individual sites is not well understood. Robust detection and mapping of A-to-I editing activity throughout the transcriptome is vital for understanding these properties and how editing affects cellular behavior. However, accurately identifying A-to-I editing sites is challenging because of inherent sampling errors present in RNA-seq. We recently developed Endonuclease V immunoprecipitation enrichment sequencing (EndoVIPER-seq) to directly address this challenge by enrichment of A-to-I edited RNAs prior to sequencing. This protocol outlines how to process cellular RNA, enrich for A-to-I edited transcripts with EndoVIPER pulldown, and prepare libraries suitable for generating RNA-seq data. © 2020 Wiley Periodicals LLC. Basic Protocol 1: mRNA fragmentation and glyoxalation Basic Protocol 2: EndoVIPER pulldown Basic Protocol 3: RNA-seq library preparation and data analysis.