Falciparum Prolylylylyl TRNAシンテターゼ活性部位と、インシリコアプローチを使用した予測されたアロステリック部位に対する選択的新規ヒットの識別

最近、潜在的なマラリア薬標的としてアミノアシルTRNAシンテターゼ（AARS）への関心が高まっています。これらの酵素は、同族TRNAにアミノ酸を添加することにより、タンパク質翻訳に重要な役割を果たします。AARSSはすべてのマラリア原虫ライフサイクル段階に存在するため、魅力的なマラリア薬標的を示しています。Prolyl TRNAシンテターゼは、TRNAをプロリンで充電する際に機能するクラスII AARです。Falciparum Prors（PFPRORS）活性部位に対するさまざまな阻害剤が設計されています。しかし、ヒト細胞に対して非常に毒性があることがわかったため、臨床試験を経験した人はいません。最近、2つの可能なアロステリックモジュレーターのPFPRORSで、グリブリドとTCMDC-124506を持つ可能性のあるアロステリック部位が報告されました。この研究では、PFPRORS活性部位とこの酵素の可能な新規アロステリックモジュレーターを標的とする新しい選択的阻害剤を特定しようとしました。これを達成するために、PFPRORSに対する南アフリカの天然化合物の仮想スクリーニングとAutoDock Vinaを使用して人間のホモログを実施しました。リガンド結合によるタンパク質運動の変調は、化学シミュレーション（GROMACS）ツールのためにGroningenマシンを使用して、分子動力学（MD）によって研究されました。リガンド結合、主成分分析（PCA）、および自由エネルギー環境（FEL）の計算に対するタンパク質のグローバルな動きとエネルギー変化をさらに分析するために。さらに、タンパク質通信に対するリガンド結合の効果を理解するために、MD-Taskツールを使用してMD軌道の動的残基ネットワーク（DRN）分析を実行しました。合計10個の潜在的な天然ヒット化合物が、強力な結合エネルギースコアで特定されました。タンパク質へのリガンドの結合により、観察可能なグローバルおよび残基レベルの変化が生じました。動的残基ネットワークの計算では、これらの残基がタンパク質コミュニケーションにおいて重要であることを示唆するアロステリック部位の残基の中間中心性（BC）メトリックの増加が示されました。残基300と350とアンチコドン結合ドメインの間の触媒ドメインのループ領域は、PC1とPC2の両方に大きな寄与を示しました。残基697と710の間のZドメインのループで大きな動きが観察されました。これは、この領域の残基の柔軟性の増加を示すRMSF計算と一致していました。このループ領域の残基はATP結合に関係しているため、ダイナミクスの変化はATP結合親和性に影響を与える可能性があります。自由エネルギー景観（FEL）の計算により、ホロタンパク質（タンパク質ADN複合体）およびPFPRORS-SANC184複合体は、中間体が非常に少なく、低エネルギーの障壁をほとんど識別できない低エネルギーによって示されるように、安定していることが示されました。さらに、FELの結果は、安定した複合体が正常なRMSD分布を示し、不安定な複合体にマルチモーダルRMSD分布を示したバックボーンRMSD分布プロットと一致しました。中心の中心性メトリックは、アロステリックリガンド結合に対する重要なATP結合部位残基の機能的重要性の喪失を示しました。アロステリック領域で観察された平均Lの深い盆地は、この領域に残留物のアクセスが高いことを意味します。BCおよび平均Lメトリックデータをさらに分析するために、ホロタンパク質BCまたはLマトリックスの各値をリガンド結合複合体BCまたはLマトリックスの対応する値を少なくすることにより、ΔBCおよびΔL値を計算しました。興味深いことに、アロステリック複合体では、ATP結合に関係するループ領域に位置する残基は負のΔL値を持っていましたが、オルソステリック錯体では、これらの残基は正のΔL値でした。アロステリック部位での残基Ser263、Thr267、Tyr285、およびLEU707間の接触頻度の増加とATP結合TXEループでのThr397、Pro398、Thr402、およびGLN395の残基が観察されました。要約すると、この研究では、PFPRORSに対する5つの潜在的なオルソステリック阻害剤と5つのアロステリックモジュレーターが特定されました。Allostericモジュレーターは、R​​MSF、PCA、およびDRN計算で示されるように、ATP結合部位のダイナミクスを変更しました。ATP結合部位のダイナミクスの変化と提案されたアロステリック部位とATP結合部位の残基間の接触頻度の増加は、アロステリックモジュレーターがATP結合部位を歪め、したがってPFPRORを阻害する可能性があることを説明する可能性があります。この研究で特定されたヒットの足場は、ヒト細胞毒性が低い抗マラリア性阻害剤の発達の出発点として使用できます。

Recently, there has been increased interest in aminoacyl tRNA synthetases (aaRSs) as potential malarial drug targets. These enzymes play a key role in protein translation by the addition of amino acids to their cognate tRNA. The aaRSs are present in all Plasmodium life cycle stages, and thus present an attractive malarial drug target. Prolyl tRNA synthetase is a class II aaRS that functions in charging tRNA with proline. Various inhibitors against Plasmodium falciparum ProRS (PfProRS) active site have been designed. However, none have gone through clinical trials as they have been found to be highly toxic to human cells. Recently, a possible allosteric site was reported in PfProRS with two possible allosteric modulators: glyburide and TCMDC-124506. In this study, we sought to identify novel selective inhibitors targeting PfProRS active site and possible novel allosteric modulators of this enzyme. To achieve this, virtual screening of South African natural compounds against PfProRS and the human homologue was carried out using AutoDock Vina. The modulation of protein motions by ligand binding was studied by molecular dynamics (MD) using the GROningen MAchine for Chemical Simulations (GROMACS) tool. To further analyse the protein global motions and energetic changes upon ligand binding, principal component analysis (PCA), and free energy landscape (FEL) calculations were performed. Further, to understand the effect of ligand binding on the protein communication, dynamic residue network (DRN) analysis of the MD trajectories was carried out using the MD-TASK tool. A total of ten potential natural hit compounds were identified with strong binding energy scores. Binding of ligands to the protein caused observable global and residue level changes. Dynamic residue network calculations showed increase in betweenness centrality (BC) metric of residues at the allosteric site implying these residues are important in protein communication. A loop region at the catalytic domain between residues 300 and 350 and the anticodon binding domain showed significant contributions to both PC1 and PC2. Large motions were observed at a loop in the Z-domain between residues 697 and 710 which was also in agreement with RMSF calculations that showed increase in flexibility of residues in this region. Residues in this loop region are implicated in ATP binding and thus a change in dynamics may affect ATP binding affinity. Free energy landscape (FEL) calculations showed that the holo protein (protein-ADN complex) and PfProRS-SANC184 complexes were stable, as shown by the low energy with very few intermediates and hardly distinguishable low energy barriers. In addition, FEL results agreed with backbone RMSD distribution plots where stable complexes showed a normal RMSD distribution while unstable complexes had multimodal RMSD distribution. The betweenness centrality metric showed a loss of functional importance of key ATP binding site residues upon allosteric ligand binding. The deep basins in average L observed at the allosteric region imply that there is high accessibility of residues at this region. To further analyse BC and average L metrics data, we calculated the ΔBC and ΔL values by taking each value in the holo protein BC or L matrix less the corresponding value in the ligand-bound complex BC or L matrix. Interestingly, in allosteric complexes, residues located in a loop region implicated in ATP binding had negative ΔL values while in orthosteric complexes these residues had positive ΔL values. An increase in contact frequency between residues Ser263, Thr267, Tyr285, and Leu707 at the allosteric site and residues Thr397, Pro398, Thr402, and Gln395 at the ATP binding TXE loop was observed. In summary, this study identified five potential orthosteric inhibitors and five allosteric modulators against PfProRS. Allosteric modulators changed ATP binding site dynamics, as shown by RMSF, PCA, and DRN calculations. Changes in dynamics of the ATP binding site and increased contact frequency between residues at the proposed allosteric site and the ATP binding site may explain how allosteric modulators distort the ATP binding site and thus might inhibit PfProRS. The scaffolds of the identified hits in the study can be used as a starting point for antimalarial inhibitor development with low human cytotoxicity.