AP-TSS：特定の挑戦的な転写開始部位からのRNA発現を分析するための新しい方法

転写、スプライシング、翻訳の調節に関与する代替プロモーターの使用は、プロテオームの多様性に貢献し、特に癌、特に多くの疾患に関与しています。エピジェネティックなメカニズムとCIS調節要素は、代替プロモーター活性に関与しています。異なる転写開始部位（TSS）での転写の開始により、遺伝子から複数の転写産物アイソフォームを生成できます。これらの転写産物には、RT-QPCR中に識別を許可する領域がないため、定量化は技術的に困難になります。この研究は、AP-TSSと呼ばれる特定のTSSから合成された転写産物の相対的な定量化のための一般的な方法を示しています（特定のTSSの分析）。AP-TSSは、目的のcDNAの特定の伸長に基づいており、その後QPCRによる定量化が続きます。原理の証明として、AP-TSSは、特定のサブテロマーTSSからのテロメアリピート含有RNA（Terra）とALU転写産物の2つの非コードRNAに適用されました。DNAメチル化阻害剤による細胞の治療は、総テラレベルの世界的な増加と関連していましたが、目的のTSSからのテラ発現はHT1080細胞では変化せず、HELA細胞ではわずかに増加しました。この結果は、ゲノムのグローバルな脱メチル化によって誘発されるテラアップレギュレーションは、主にこの特定のTSS以外の部位からの活性化によるものであることを示唆しています。ALU RNAの場合、AP-TSSによって得られたシグナルは、RNAポリメラーゼIII依存性ALU転写産物に特異的です。要約すると、私たちの方法は、多くの遺伝子に適用できるさまざまな条件で、特定の転写開始部位から遺伝子発現の調節を研究するためのツールを提供します。特に、AP-TSSを使用して、エピジェネティックな標的療法の開発に重要な代替TSS使用のエピジェネティックな調節を調査できます。

Alternative promoter usage involved in the regulation of transcription, splicing, and translation contributes to proteome diversity and is involved in a large number of diseases, in particular, cancer. Epigenetic mechanisms and cis regulatory elements are involved in alternative promoter activity. Multiple transcript isoforms can be produced from a gene, due to the initiation of transcription at different transcription start sites (TSS). These transcripts may not have regions that allow discrimination during RT-qPCR, making quantification technically challenging. This study presents a general method for the relative quantification of a transcript synthesized from a particular TSS that we called AP-TSS (analysis of particular TSS). AP-TSS is based on the specific elongation of the cDNA of interest, followed by its quantification by qPCR. As proof of principle, AP-TSS was applied to two non-coding RNA: telomeric repeat-containing RNAs (TERRA) from a particular subtelomeric TSS, and Alu transcripts. The treatment of cells with a DNA methylation inhibitor was associated with a global increase of the total TERRA level, but the TERRA expression from the TSS of interest did not change in HT1080 cells, and only modestly increased in HeLa cells. This result suggests that TERRA upregulation induced by global demethylation of the genome is mainly due to activation from sites other than this particular TSS. For Alu RNA, the signal obtained by AP-TSS is specific for the RNA Polymerase III-dependent Alu transcript. In summary, our method provides a tool to study regulation of gene expression from a given transcription start site, in different conditions that could be applied to many genes. In particular, AP-TSS can be used to investigate the epigenetic regulation of alternative TSS usage that is of importance for the development of epigenetic-targeted therapies.