アビジン様タンパク質タマビジン2-REVを使用したビオチン化部位のバイオイドスクリーニングは、インターフェロン遺伝子の刺激装置（STING）のグローバルな相互作用因子を識別します。

インターフェロン遺伝子（STING）の刺激装置は、膜輸送を介してサイトゾル誘発性の自然免疫シグナル伝達を媒介します。STINGと空間的に相互作用するタンパク質のグローバルな識別は、その人身売買メカニズムとSTINGシグナル伝達経路をよりよく理解します。近接依存性ビオチン同定（バイオイド）は、生細胞における生理学的に関連するタンパク質間相互作用を特定するための強力な技術です。しかし、ビオチン - スレプトアビジンの相互作用が強すぎるため、ビオチン化ペプチドは従来のバイオイド法ではめったに検出されません。その結果、非ビオチン化ペプチドのみが同定されており、これは非特異的にプルダウンしたタンパク質のペプチドと区別することはできません。ここでは、可逆的なビオチン結合能力を備えた技術的なアビジン様タンパク質であるタマビジン2-REVを使用して、効率的かつ特異的にビオチン化ペプチドを濃縮する簡単な方法を開発しました。RAW264.7マクロファージをターボイド融合刺し刺しを安定して発現させるマクロファージを使用して、刺すような繁殖タンパク質の4,000を超えるビオチン化ペプチドを特定して定量化しました。さまざまな小胞体関連タンパク質が刺激されていない細胞でビオチン化され、刺すような活性化により、ゴルジとエンドソームに位置する多くのタンパク質のビオチン化が引き起こされました。これらのタンパク質には、タンク結合キナーゼ1（TBK1）、いくつかのパルミトイルトランスフェラーゼ、P62/隔離ソソーム1（SQSTM1）など、活性化された刺し傷と相互作用することが知られているタンパク質が含まれていました。さらに、インターフェロン誘発性膜貫通タンパク質3（IFITM3）は、エンドリソソームに局在する抗ウイルスタンパク質であり、後期活性化段階で刺すように結合しています。これらの動的な相互作用プロファイルは、刺すようなシグナル伝達に関する詳細な洞察を提供します。タマビジン2-REVを使用したアプローチは、バイオイドベースのビオチン化ベースのペプチド同定方法に役立つことを提案します。

Stimulator of interferon genes (STING) mediates cytosolic DNA-induced innate immune signaling via membrane trafficking. The global identification of proteins that spatiotemporally interact with STING will provide a better understanding of its trafficking mechanisms and of STING signaling pathways. Proximity-dependent biotin identification (BioID) is a powerful technology to identify physiologically relevant protein-protein interactions in living cells. However, biotinylated peptides are rarely detected in the conventional BioID method, which uses streptavidin beads to pull down biotinylated proteins, because the biotin-streptavidin interaction is too strong. As a result, only nonbiotinylated peptides are identified, which cannot be distinguished from peptides of nonspecifically pull-downed proteins. Here, we developed a simple method to efficiently and specifically enrich biotinylated peptides using Tamavidin 2-REV, an engineered avidin-like protein with reversible biotin-binding capability. Using RAW264.7 macrophages stably expressing TurboID-fused STING, we identified and quantified >4,000 biotinylated peptides of STING-proximal proteins. Various endoplasmic reticulum-associated proteins were biotinylated in unstimulated cells, and STING activation caused biotinylation of many proteins located in the Golgi and endosomes. These proteins included those known to interact with activated STING, such as TANK-binding kinase 1 (TBK1), several palmitoyl transferases, and p62/sequestosome 1 (SQSTM1). Furthermore, interferon-induced transmembrane protein 3 (IFITM3), an endolysosome-localized antiviral protein, bound to STING at the late activation stage. These dynamic interaction profiles will provide detailed insights into STING signaling; we propose that our approach using Tamavidin 2-REV would be useful for BioID-based and other biotinylation-based peptide identification methods.