シングルセル遺伝子調節ネットワーク分析のためのスケーラブルな風光明媚なワークフロー

このプロトコルでは、ソフトウェアコンテナとNextFlowパイプラインを使用して、単一セルRNAシーケンスデータの標準的なベストプラクティスのステップとともに、高速景観分析を実行する方法について説明します。風光明媚な再構築レギュロン（すなわち、転写因子とその標的遺伝子）は、個々の細胞でこれらの発見されたレギュロンの活性を評価し、これらの細胞活性パターンを使用して、細胞の意味のあるクラスターを見つけます。ここでは、いくつかの進歩を伴う風光明媚な改良版を提示します。風光明媚なものは、Python（Pyscenic）でリファクタリングされ、再実装されており、その結果、速度が10倍増加し、使いやすいようにコンテナにパッケージ化されています。また、レギュロンを改良して、エピゲノミックトラックデータベースとモチーフを使用することも可能になりました。このプロトコルでは、風光明媚なさまざまなステップを説明します。ワークフローは、すべての細胞の遺伝子の存在量を示すカウントマトリックスから始まり、3つの段階で構成されています。まず、共発現モジュールは、ターゲットあたりの回帰アプローチ（GRNBOOST2）を使用して推測されます。次に、間接ターゲットは、シス調節モチーフ発見（CISTARGET）を使用してこれらのモジュールから剪定されます。最後に、これらのレギュロンの活性は、Regulonの標的遺伝子（Aucell）の濃縮スコアを介して定量化されます。非線形投影法を使用して、これらのレギュロンの細胞活動パターンに基づいて細胞の視覚的なグループ化を表示できます。結果は、織機ファイルとしてエクスポートし、Scope Webアプリケーションで視覚化できます。このプロトコルは、末梢血単核細胞データセットと単一細胞RNAシーケンスがん実験のパネルの2つのユースケースに示されています。10,000個の遺伝子と50,000個のセルのデータセットの場合、パイプラインは2時間未満で動作します。

This protocol explains how to perform a fast SCENIC analysis alongside standard best practices steps on single-cell RNA-sequencing data using software containers and Nextflow pipelines. SCENIC reconstructs regulons (i.e., transcription factors and their target genes) assesses the activity of these discovered regulons in individual cells and uses these cellular activity patterns to find meaningful clusters of cells. Here we present an improved version of SCENIC with several advances. SCENIC has been refactored and reimplemented in Python (pySCENIC), resulting in a tenfold increase in speed, and has been packaged into containers for ease of use. It is now also possible to use epigenomic track databases, as well as motifs, to refine regulons. In this protocol, we explain the different steps of SCENIC: the workflow starts from the count matrix depicting the gene abundances for all cells and consists of three stages. First, coexpression modules are inferred using a regression per-target approach (GRNBoost2). Next, the indirect targets are pruned from these modules using cis-regulatory motif discovery (cisTarget). Lastly, the activity of these regulons is quantified via an enrichment score for the regulon's target genes (AUCell). Nonlinear projection methods can be used to display visual groupings of cells based on the cellular activity patterns of these regulons. The results can be exported as a loom file and visualized in the SCope web application. This protocol is illustrated on two use cases: a peripheral blood mononuclear cell data set and a panel of single-cell RNA-sequencing cancer experiments. For a data set of 10,000 genes and 50,000 cells, the pipeline runs in <2 h.