タンパク質Gで覆われたマイクロタイタープレートに共有結合固定化抗体を備えた再利用可能なオンプレート免疫沈降方法

タンパク質Gビーズに対する抗体の共有結合固定化は、基本的な分子生物学法ですが、ビーズは回復の結果が低いことを示しています。私たちの目的は、固定化された抗体合法的な複合体を非常に小規模で再利用することでした。したがって、標準の96ウェルマイクロプレートのウェルで使用する架橋手順を最適化しました。使用される方法には、抗体のタンパク質G表面への親和性結合が含まれ、その後、異なる架橋試薬、DMP、BS3を使用して固定化ステップが続き、架橋反応を消し、抗体特異的抗原を結合します。手順を縮小することにより、EGFR架橋井戸を20回以上再利用することができました。この方法は、免疫沈降、タンパク質および細胞溶解物の精製、標的タンパク質濃縮のために、機能化されたナノセンサーを含む、固定化された形態のタンパク質Gを含む広範囲の固体サポートでアッセイを実行することができます。

Covalent immobilization of antibodies to protein G beads is a basic molecular biology method, although the beads present poor recovery results. Our aim was to reuse the immobilized antibody-protein G complex on a very small scale, therefore we optimized the crosslinking procedure to be used on the wells of a standard 96-well microplate. The method used involves the affinity binding of the antibody to the protein G surface, followed by the immobilization step using different crosslinking reagents, DMP and BS3, quenching the crosslinking reaction, and binding the antibody-specific antigen. By scaling down the procedure, we were able to reuse the anti-EGFR crosslinked wells more than 20 times. This method can be used to perform assays on a wide range of solid supports containing the protein G in an immobilized form, including functionalized nanosensors, for immunoprecipitation, protein and cell lysate purification, target protein enrichment.