ヒト多能性幹細胞からの内耳オルガノイドの生成

内耳の感覚上皮には、音、重力、およびヘッドモーションシグナルを伝達する機械感受性有毛細胞が含まれています。このプロトコルは、in vitro 3D分化法を説明します。これにより、毛細胞を抱く内耳感覚上皮がヒト多能性幹細胞（HPSC）に由来します。分化を開始するために、HPSCは低結合96ウェルプレートに凝集し、細胞外マトリックスタンパク質で処理して上皮化を促進します。in vivo内耳の発達中のシグナル伝達経路の活性化と減衰を要約することにより、凝集体は、BMP、FGF、WNTなどのシグナル伝達経路を段階的に調節する小分子と組換えタンパク質で処理されます。これらの治療は、非神経外胚葉（NNE）、耳のエピブランチャール前駆細胞ドメイン（OEPD）、および耳障りなプラコードの連続形成を誘導します。その後、耳障りなカメラシは自己誘導性の形態形成を受けて、最終的には内耳有毛細胞と支持細胞を含む感覚上皮を生じさせ、有毛細胞とのシナプスを形成するニューロンを生じさせます。これらのHPSC由来の内耳感覚構造は、人間の内耳オルガノイドと指定されています。人間の内耳生検は患者の聴覚系に重傷を負わずに得ることがほとんど不可能であるため、人間の内耳オルガノイドシステムは、人間の内耳疾患と発達を研究するための強力なin vitroプラットフォームを提供します。

The sensory epithelia of the inner ear contain mechanosensitive hair cells that transmit sound, gravity and head motion signals. This protocol describes an in vitro 3D differentiation method, by which the inner ear sensory epithelium harboring hair cells are derived from human pluripotent stem cells (hPSCs). To begin the differentiation, hPSCs are aggregated in low-binding 96-well plates and treated with extracellular matrix proteins to promote epithelialization. By recapitulating signaling pathway activation and attenuation during in vivo inner ear development, the aggregates are treated with small molecules and recombinant proteins that modulate signaling pathways such as BMP, FGF and WNT in a stepwise manner. These treatments induce sequential formation of non-neural ectoderm (NNE), otic-epibranchial progenitor domain (OEPD), and otic placodes. The otic placodes subsequently undergo self-guided morphogenesis to form otic vesicles, which eventually give rise to sensory epithelia containing inner ear hair cells and supporting cells, as well as neurons forming synapses with the hair cells. These hPSC-derived inner ear sensory structures are designated human inner ear organoids. As human inner ear biopsies are nearly impossible to obtain without causing severe injuries to the auditory system of the patients, the human inner ear organoid system provides a powerful in vitro platform for studying human inner ear disease and development.