LC-HRMSによるペプチド薬物の異化の研究のためのさまざまなタンパク質沈殿と固相抽出プロトコルの比較

ペプチド異化の生成物のLC-HRMSベースの同定は、より安定した化合物の設計を促進するための鍵です。特定のペプチドの異化は、物理化学的特性の観点から親化合物や他の異化鉱とは大きく異なる可能性があるため、親およびすべての親関連の異化剤の回復と検出を可能にする分析方法を開発することは困難な場合があります。この研究の目的は、ペプチド薬物とその代謝の回復とマトリックス効果が、異なるタンパク質沈殿（PP）および固相抽出（SPE）プロトコルによってどのように影響を受けるかを調査することでした。この目的のために、さまざまなクラス（ソマトスタチン、GLP-2、ヒトインスリン、リラグルチド）を代表する4つのモデルペプチドをトリプシンとキモトリプシンで消化して、タンパク質分解異文体をシミュレートしました。親ペプチドの結果として生じる混合物と、広範囲の相対疎水性（HR）と等電点（PI）をカバーするそのタンパク質分解生成物は、ヒト血漿でスパイクされ、異なるPPおよびSPEプロトコルを受けました。各ペプチドとその異化剤について、回復およびマトリックス効果を測定しました。3巻のACNまたはETOHを備えたPPは、すべてのテストされたPPおよびSPEプロトコルの中で、最高の全体的な回収率（4つの親ペプチドとそのすべての異化作品で50％以上）を生成しました。混合モードアニオン交換（MAX）は、回収率が20％以上ですべてのペプチドを抽出することを可能にした5つのテストされたテストの中で唯一のSpe Sorbentでした。マトリックス効果は一般にSPEで低かった。全体として、高い親水性（たとえば、ソマトスタチン異系石岩）または疎水性（GLP-2および脂質化するリラグルチド異化団体）のいずれかのペプチドが、PP溶媒またはSPEプロトコルの選択がはるかに狭いことが観察されました。組換え酵素を使用した異化のシミュレーションと、ペプチド異化の研究のための最適な抽出条件を選択するために、HRおよび潜在的なタンパク質分解産物のPIとのin silico計算とともに推奨されます。

LC-HRMS-based identification of the products of peptide catabolism is the key to drive the design of more stable compounds. Because the catabolite of a given peptide can be very different from the parent compound and from other catabolites in terms of physicochemical properties, it can be challenging to develop an analytical method that allows recovery and detection of the parent and all parent-related catabolites. The aim of this study was to investigate how the recovery and the matrix effect of peptidic drugs and their catabolites are affected by different protein precipitation (PP) and solid-phase extraction (SPE) protocols. To this purpose, four model peptides representative of different classes (somatostatin, GLP-2, human insulin and liraglutide) were digested with trypsin and chymotrypsin to simulate proteolytic catabolism. The resulting mixtures of the parent peptides and their proteolytic products covering a wide range of relative hydrophobicity (HR ) and isoelectric points (pI) were spiked in human plasma and underwent different PP and SPE protocols. Recovery and matrix effect were measured for each peptide and its catabolites. PP with three volumes of ACN or EtOH yielded the highest overall recoveries (more than 50% for the four parent peptides and all their catabolites) among all the tested PP and SPE protocols. Mixed-mode anion exchange (MAX) was the only SPE sorbent among the five tested that allowed to extract all the peptides with recoveries more than 20%. Matrix effect was generally lower with SPE. Overall, it was observed that peptides with either high hydrophilicity (e.g., somatostatin catabolites) or hydrophobicity (GLP-2 and lipidated liraglutide catabolites) had a much narrower choice of PP solvent or SPE protocol. Simulation of catabolism using recombinant enzymes together with in silico calculation of the HR and the pI of potential proteolysis products is recommended to select the optimal extraction conditions for the study of peptide catabolism.