IgG4ヒンジ領域の安定化によるファブアーム交換と抗体還元の予防

IgG4Sは、Fab-Arm Exchangeと呼ばれるプロセスを受ける動的な分子です。重鎖間のジスルフィド結合は一時的に減少し、他のIgG4半抗体と無傷の抗体を改善する半分の抗体が生じます。in vivoでは、治療的IgG4は内因性IgG4Sで再結合する可能性があり、その結果、二重特異性抗体の不均一な混合物が生成されます。製造中にあらゆる治療タンパク質で発生する可能性のある関連する問題は、インターチェーンジスルフィド結合の減少です。IgG4Sの場合、これは主に、精製プロセスを通じて持続する高レベルの半マブをもたらします。S228P変異は、半症の形成を防ぐために使用されています。ただし、S228P変異を持つIgG4Sは、環境を削減する際に半層の形成とファブアーム交換の影響を受けることを実証しました。ヒンジ領域に追加のジスルフィド結合を組み込むことにより、重い鎖相互作用を安定させる2つの新しい変異を特定しました。個々に、これらの変異は還元に向けて安定性を高め、ファブアーム交換を減らします。3つの突然変異すべて、Y219C、G220C、およびS228Pの組み合わせには、FAB-ARMの交換を防ぎながら、還元に対する安定性が7倍増加するIgG4をもたらす加法利益が得られます。重要なことに、変異は抗原結合またはFCエフェクター機能に影響しないことです。これらの突然変異は、製造中のMAB削減を解決し、in vivoでのファブアーム交換を防ぐことに大きな有望です。

IgG4s are dynamic molecules that undergo a process called Fab-arm exchange. Disulfide bonds between heavy chains are transiently reduced, resulting in half antibodies that reform intact antibodies with other IgG4 half antibodies. In vivo, therapeutic IgG4s can recombine with endogenous IgG4s, resulting in a heterogeneous mixture of bispecific antibodies. A related issue that can occur for any therapeutic protein during manufacturing is interchain disulfide bond reduction. For IgG4s, this primarily results in high levels of half-mAb that persist through purification processes. The S228P mutation has been used to prevent half-mAb formation. However, we demonstrated that IgG4s with the S228P mutation are subject to half-mAb formation and Fab-arm exchange in reducing environments. We identified two novel mutations that stabilize the heavy-heavy chain interaction via incorporation of additional disulfide bonds in the hinge region. Individually, these mutations increase stability toward reduction and lessen Fab-arm exchange. Combination of all three mutations, Y219C, G220C, and S228P, has an additive benefit resulting in an IgG4 with ˃7-fold increase in stability toward reduction while preventing Fab-arm exchange. Importantly, the mutations do not affect antigen binding or Fc effector function. These mutations hold great promise for solving mAb reduction during manufacturing and preventing Fab-arm exchange in vivo.